白菜型油菜IPT基因家族鉴定及表达分析

异戊烯基转移酶(isopentenyltransferase,IPT)是细胞分裂素生物合成的第一限速酶,为分析IPT基因家族在白菜型油菜生长中的功能,利用生物信息学方法从其基因组中鉴定出13个BrIPT基因,它们不均匀地分布在7条染色体上。BrIPTs可分为4个亚族,各家族成员均含有8~10个保守基序和1~2个UTR区。BrIPT基因的启动子区域包含众多响应元件。BrIPT基因家族成员受环境因子、生物激素及防御与应激调控。qRTPCR结果显示,tRNA-IPT基因BrIPT4、BrIPT6、BrIPT9在白菜型油菜体内各个部位均有表达。相比于苗期,成熟期白菜型油菜IPT基因的表达量更高,为后续深入研究IPT基因家族成员的生理生化功能提供了理论依据。

大白菜BrCYP83B1基因的克隆及表达分析

【目的】细胞色素P450家族是十字花科植物硫苷合成重要的酶系,其中CYP83亚家族主要参与核心结构的合成,旨在探究大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)CYP83B1基因的功能。【方法】利用RT-PCR技术克隆BrCYP83B1基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白理化性质、同源性及启动子顺式作用元件,利用RT-qPCR技术分析BrCYP83B1的表达模式,并构建其植物超表达载体。【结果】BrCYP83B1 cDNA序列全长为1500 bp,编码499个氨基酸,编码蛋白属于细胞色素P450超家族,主要定位于细胞质,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,与甘蓝型油菜、青花菜的CYP83B1蛋白具有较高的同源性。启动子分析表明,该基因启动子区域包含水杨酸、脱落酸及茉莉酸甲酯等激素响应的顺式作用元件,说明BrCYP83B1基因表达可能受激素调控。RT-qPCR分析结果表明,BrCYP83B1基因在大白菜的根、茎、叶、花和果中均有表达,且以叶中的表达量最高;茉莉酸甲酯够显著促进该基因的表达,而水杨酸处理对其表达具有一定的抑制作用,脱落酸处理下基因先上调后又下调。【结论】BrCYP83B1可能参与大白菜对激素的响应调控。

甘蓝型黄籽油菜粒色基因候选区间的QTL-Seq定位及连锁标记开发

甘蓝型油菜黄籽性状遗传来源较为复杂且易受环境条件影响,基因定位和分子标记开发难度大.相比于传统QTL定位,结合二代深度测序等生信方法直接对甘蓝型油菜黄籽基因进行染色体定位、基因挖掘和标记开发,将有助于黄籽遗传机理的研究.利用甘蓝型油菜黄籽临保系63-2和黑籽67-1配制杂交组合,构建F 2粒色分离群体.遗传分析表明:该群体中黄籽性状受1对隐性主效基因控制;以法国甘蓝型油菜Darmor-bzh基因组为参考,利用集团分离分析法和全基因组重测序将黄籽性状基因定位于C03染色体6.1~9.0 Mb置信区间内,同时基于基因组变异和聚丙烯酰胺凝胶电泳验证获得与粒色基因紧密连锁的SSR标记4个和InDel标记5个.

青花菜霜霉病响应基因BoiWRKY25的克隆及表达分析

WRKY是植物特有的转录因子,在生长发育和逆境胁迫响应过程中起着重要作用。为了明确BoiWRKY25在霜霉病抗性反应中的作用,本研究以青花菜为材料,利用PCR法克隆该基因,在序列分析和表达分析的基础上,利用过量表达研究其功能。结果表明,BoiWRKY25的基因组全长为1 395 bp,有4个内含子。BoiWRKY25的编码区全长为1 086 bp,编码361个氨基酸,分子量为40.4 kDa,等电点为6.98。BoiWRKY25的平均亲水性指数为-0.857,是一种亲水蛋白。BoiWRKY25具2个WRKY结构域,每个结构域由1个WRKYGQK七肽和1个C2H2型锌指结构组成,锌指结构可分别用C-X4-C-X22-H-X1-H和C-X4-C-X23-H-X1-H表示。基因表达结果表明,BoiWRKY25的表达受霜霉菌的诱导,表达量在72 h时达到最大值,为对照的4.6倍;过量表达植株对霜霉病的抗性显著降低,同时病程相关蛋白基因BoiPR1的表达量降低,表明BoiWRKY25在霜霉病抗性反应中起负调控作用。转录因子基因BoiWRKY25的克隆与表达分析,为后续开展青花菜霜霉病抗性机理研究及分子育种奠定了基础。

青花菜转录因子基因BoiWRKY8及其与抗病性的关系

WRKY转录因子是植物特有的一类调控蛋白,在抵御生物和非生物逆境中起着重要作用。为初步明确该基因在抗病反应中的功能,本研究在分离青花菜BoiWRKY8基因的基础上,利用生物信息学方法进行序列分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)明确其在核盘菌、灰霉菌侵染下的表达模式,并对过量表达植株进行抗病性鉴定。结果表明,BoiWRKY8的基因组全长为3170 bp,具2个内含子,长度分别为776和1422 bp。编码区全长为972 bp,编码323个氨基酸,WRKY结构域由60个氨基酸组成,包括一个WRKYGQK序列和一个C_(2)H_(2)锌指结构C-X_(4)-C-X_(23)-H-X_(1)-H。系统发育分析结果表明,BoiWRKY8与芸薹属植物的同源序列聚为一组,支持率达100%,与野甘蓝的关系最近。qRT-PCR结果显示,BoiWRKY8受核盘菌和灰霉菌的诱导,在6和12 h时的表达量最大,为对照的3.18/2.68和3.22/2.90倍;BoiWRKY8过量表达植株对核盘菌、灰霉菌的抗性显著增强,JA/ET通路标志基因BoPDF1.2的表达量显著提高。本研究结果为后续开展青花菜抗病机理研究和分子育种奠定了基础。

海拔变化对棒菜主要农艺性状及产量的影响

【目的】分析海拔变化对棒菜(Brassica juncea var.crassicaulis Chen&Yang)主要农艺性状及产量的影响,为优化川西高原棒菜种植区域提供理论依据。【方法】以金田3号棒菜为试材,采用变异分析研究其主要农艺性状和产量性状在不同海拔(1510、2081、2579和2936 m)的差异,采用相关分析、逐步回归分析和通径分析研究海拔及各性状指标与棒菜产量的关系。【结果】不同海拔高度下,棒菜各性状的变异系数为4.88%~33.51%,农艺性状以食用茎粗的变异系数最大,产量性状以单株毛重的变异系数最大。株高和食用茎长随海拔上升总体减小,且与海拔呈极显著负相关(P<0.01,下同);食用茎粗、皮厚、单株毛重、单株净重和小区产量随海拔上升总体先增大后减小,且与海拔呈极显著正相关;小区产量与食用茎粗、皮厚、单株毛重和单株净重呈显著(P<0.05)或极显著正相关。逐步回归分析结果表明,棒菜产量变化主要受海拔、食用茎粗、茎秆节间长度和单株毛重的影响,决定系数为0.993;4个自变量对小区产量的直接通径系数排序依次为海拔(0.484)>单株毛重(0.421)>食用茎粗(0.338)>茎秆节间长度(0.180),间接通径系数排序依次为食用茎粗(0.495)>单株毛重(0.479)>海拔(0.450)>茎秆节间长度(0.127)。【结论】为使金田3号棒菜在川西高原地区有较高的产量,应重点做好海拔、食用茎粗和单株毛重的选择,同时兼顾茎秆节间长度。金田3号棒菜在海拔2579 m产量最高,可在该区域适度扩大种植规模。

摘薹对甘蓝型油菜籽粒品质性状的影响及其综合评价

为了探明摘薹对油菜籽粒品质性状的影响,研究以21份甘蓝型油菜品系为材料,进行摘薹处理与正常收获,测定籽粒中饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、油脂、蛋白质及硫苷含量变化。结果表明:摘薹后棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、蛋白质及硫苷含量表现为增加的趋势,油酸、油脂含量表现为减少的趋势,芥酸、花生烯酸含量变化趋势并不明显。相关性分析表明,摘薹后油脂与油酸呈极显著正相关,二者均与棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、蛋白质呈极显著负相关。主成分及隶属函数分析表明,摘薹后y15油菜品系籽粒综合性状最优良,y12、y10、y14、y6、y19、y11、y7、y13、y20、y3、y8品系次之,y4、y2、y9品系综合得分低于对照y21。

种植密度和施氮量对油菜生长发育及产量的影响

为探究氮肥与密度互作对甘蓝型油菜生长发育和产量的影响,以‘云油杂28号’为材料,设置3个密度梯度,D_(1):15万株/hm^(2);D_(2):28.5万株/hm^(2);D_(3):42万株/hm^(2),4个施氮量水平,N_(1):0 kg/hm^(2);N_(2):75 kg/hm^(2);N3:150 kg/hm^(2);N4:225 kg/hm^(2),测定不同处理下的生育期、农艺性状、干物质重量和产量等指标。结果表明:同一种植密度下,全生育期随施氮量的增加而延长,盛花期根茎粗、叶面积、总叶数和绿叶数在D_(1)密度下随施氮量的增加先上升后降低;干物重和产量在各密度下均随施氮量的增加先升高后降低,均在D_(1)N_(2)下达到最大值。同一施氮量下,全生育期随种植密度的增加呈缩短趋势;根茎粗、总叶数、绿叶数和叶面积在抽薹期和盛花期均随种植密度的提高而降低;各时期的干物重和产量随种植密度的增加而降低。种植密度和氮肥对油菜生长发育前期的影响较小,主要从抽薹期和开花期开始产生影响;调整种植密度对产量和干物重的影响大于施氮量,密度和施氮量主要通过单株有效角果数影响油菜产量。在密度与氮肥的互作处理下以D_(1)N_(2)处理(即密度为15万株/hm^(2),施氮为75 kg/hm^(2))最优,其株高最高,总叶数和绿叶数最多,根茎粗和叶面积较大,单株产量和小区产量最高。

甘蓝型油菜高亚麻酸CMS的快速选育方法及效果研究

为了加速甘蓝型油菜高亚麻酸杂交育种进程。以高亚麻酸油菜种质为试验材料,采用快速选育方法进行油菜高亚麻酸CMS及保持系的选育。结果表明:选育周期从5~6年缩短为4年,亚麻酸含量由11.85%提升至16.96%,含油量由45.0%提升至48.8%,单株亚麻酸产出量由0.98 g提升至1.53 g。与原CMS(陕6A)相比,“YM-1A”的含油量、单株产量、亚麻酸含量、异交结实系数、单株亚麻酸产量分别提高8.45%、4.49%、59.43%、12.8%、80.65%;而自交结实系数降低56.86%。因不育性、农艺、品质等性状显著提高,YM-1A在甘蓝型油菜高亚麻酸杂交育种中具有较高的利用价值。

纤维素降解菌的筛选及其对西兰花废弃茎叶品质的改善

本试验旨在筛选纤维素降解菌,并探究其用于废弃西兰花茎叶发酵的可行性。以西兰花种植土壤和实验室保藏菌种为筛选源,采用羧甲基纤维素酶(CMC)-刚果红染色法进行初筛,以CMC活性和滤纸酶(FPA)活性为指标进行复筛,获得一株高产纤维素酶的菌株,编号XLG2-1。对其进行16S rRNA基因序列分析,通过形态学及生理生化分析,确定其为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。将菌株接种于废弃西兰花茎叶中进行发酵,发现粗蛋白、小肽和粗多糖含量分别比发酵前提高了0.41、11.5和10.4百分点;粗脂肪、粗纤维和粗灰分含量分别比发酵前降低了0.21、0.25和0.02百分点。扫描电镜结果显示,发酵后的样品结构疏松,表面有大量孔洞,并有菌附着,表明该菌能分解利用西兰花废弃茎叶,有助于解决其资源化利用的难题。

基于多元统计分析对芥菜营养品质的综合评价

为建立芥菜营养品质标准评价体系,筛选优良品质的芥菜品种,采用多元统计分析方法(相关性分析、主成分分析、模糊数学隶属函数分析、聚类分析),对14份芥菜材料的干物质、VC、粗蛋白、粗纤维、葡萄糖、果糖、草酸、苹果酸、柠檬酸9个品质指标进行综合评价。结果表明:14份芥菜材料的9个品质指标均存在显著差异,变异系数在16.46%~66.67%之间,说明不同芥菜材料单一指标间的差异较大。主成分分析综合品质得分较高的是1917012、1917396、1917381,较低的是1917351、祥瑞182;通过模糊数学隶属函数分析和聚类分析评价,营养品质优良的芥菜材料为1917396、1917397、1917381,较差的为1917152、祥瑞182。综合来看,芥菜材料1917396和1917381表现优异,营养品质好。这2份材料的干物质、VC等含量较高,也证明该评价体系可以极大的消除单一指标的差异。

甘蓝型油菜373S温敏不育基因在可育细胞质背景下的表达

旨在明确甘蓝型油菜温敏不育系373S温敏不育基因表达与特定细胞质之间的关系。以甘蓝型油菜373S(微粉)为父本,以具有cam细胞质的Shaan2B为母本,杂交、回交及自交得到BC_(1)及F_(2)代群体。结果表明,在上述具有cam细胞质的BC_(1)及F_(2)中,可育株与不育株的分离比分别符合3∶1与15∶1,表明该群体中不育性状受2对基因控制。分离群体中的不育株表现出温敏不育特征,其不育花形态与373S没有明显差别;与373S比较,该分离群体中的不育植株结实角果数及自交结实率有不同程度的降低,不育期时间率(不育期时间所占百分比)无显著差异;花冠直径、四强花药长度、二弱花药长度无明显差异,花柄长度、花瓣长度、花瓣宽度、四强雄蕊长度、二弱雄蕊长度略有增加。细胞学观察表明,该分离群体中的不育株小孢子的发育过程、染色体形态、胼胝质沉积与373S无明显差异,均在花粉母细胞时期出现异常。本研究成功地将373S温敏不育基因从pol细胞质导入cam细胞质,说明该温敏不育性状是由细胞核内温敏不育基因导致,与细胞质背景无关。

芜菁多糖铁配合物的合成工艺研究

目的研究芜菁多糖铁(Ⅲ)[BP-Fe(Ⅲ)]配合物的合成工艺。方法以三氯化铁和芜菁多糖为反应物,合成一种芜菁多糖铁(Ⅲ)配合物;采用单因素法系统研究pH、反应时间、温度、枸橼酸钠与多糖质量比4个因素对BP-Fe(Ⅲ)配合物合成量的影响;采用正交实验筛选BP-Fe(Ⅲ)配合物的最优合成工艺;采用UV法测定BP-Fe(Ⅲ)配合物中的铁含量,进行铁离子特征反应实验;对BP-Fe(Ⅲ)配合物和芜菁多糖进行红外光谱表征。结果正交实验结果显示BP-Fe(Ⅲ)配合物的最优合成工艺条件为枸橼酸钠和芜菁多糖质量比2∶1,反应时间180 min,反应液pH=6,反应温度60℃,该条件下铁含量为4.53%,对BP-Fe(Ⅲ)配合物中铁含量影响顺序为:枸橼酸钠和多糖质量比(A)>反应液pH值(B)>反应时间(C)>反应温度(D);铁离子特征反应实验结果表明芜菁多糖与铁络合成稳定的配合物;红外光谱图显示芜菁多糖与铁形成的稳定配合物基本结构无较大变化。结论本方法操作简单,成本低,适用于多糖铁配合物的合成。

抗根肿病长柄芥育种材料的创制与鉴定

通过远缘杂交及回交将白菜的抗病基因导入到芥菜中,创制获得优质的抗根肿病长柄芥(Brassica juncea var.longepetiolata Yang et Chen)育种材料。采用人工接种鉴定和分子标记鉴定相结合法,对10份抗根肿病白菜材料进行抗性分析,筛选出1份可作为长柄芥抗根肿病育种材料创制的抗性资源CCR21002。利用CCR21002分别作为父本、母本提供抗根肿病基因,与长柄芥进行远缘杂交,结合胚挽救技术获得正反杂交种F1,选取植株形态偏向芥菜的F1与长柄芥回交获得BC_(1),对BC_(1)植株进行形态学、细胞学分析及抗病性鉴定。结果表明,回交一代比杂种一代更难获得,胚挽救成活的13株BC_(1)中,仅筛选出1株基因型为AABB且抗根肿病的植株,经分子标记鉴定所含抗病基因为CRb,在植株形态上保留有长柄芥的大部分性状。证明经过与抗根肿病白菜远缘杂交及回交,获得对4号生理小种表现抗性的长柄芥新种质1份,可用于继续回交转育。

286份甘蓝型油菜种质苗期耐盐碱性综合评价

对286份甘蓝型油菜品系进行苗期耐盐碱性鉴定,通过水培试验,测定盐碱胁迫处理下叶片数、绿叶数、绿叶比、株高、根长、根重等指标,通过盐碱胁迫综合评价值(D值)、极端材料筛选分析、相关性、主成分、隶属函数、频数分析和逐步回归分析法,对不同基因型的油菜种质建立苗期耐盐碱性综合评价模型并筛选出适宜的评价鉴定指标。盐碱胁迫下,叶片数与株高呈负相关,两者的相关系数未达到显著性,其他性状之间均呈正相关并达到了显著或极显著水平。利用主成分分析法将7个耐盐碱指标综合为4个主成分,可代表油菜耐盐碱性88.349%的原始数据信息量。依据4个主成分的相对重要性(权重)进行加权,得到不同基因型的耐盐碱性综合评价值(D值)。结合隶属函数分析和极端材料筛选分析,筛选出4份耐碱盐的甘蓝型油菜种质和4份盐碱敏感种质。逐步回归分析结果表明,在油菜苗期测定其绿叶数、绿叶比、地上重、根长和根重,通过回归方程估算其D值,可以初步判断甘蓝型油菜种质资源耐盐碱性。

流式细胞仪对甘蓝花粉倍性的测定

利用流式细胞仪测定甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)花粉的倍性,以甘蓝GL21028的花粉为材料,以叶片为对照,比较花粉2种处理方式、3种不同细胞裂解液、2种核酸染料的效果差异。通过B缓冲液处理后获取的花粉细胞可以直接染色,为最简便处理方式;采用“Aru”buffer和Y 2种裂解液,染色剂DAPI,处理甘蓝叶片和花粉,通过流式细胞仪检测,样本细胞DNA成峰集中,细胞碎片很少;配制的Y裂解液能够适用甘蓝材料流式细胞仪的观察。甘蓝花粉通过B缓冲液处理后,可以直接作为流式细胞仪倍性鉴定的材料,不再需要其他处理,配制的Y裂解液可以得到较好的试验结果。

大白菜BrMLP328的克隆、表达及功能验证

【目的】克隆大白菜BrMLP328基因,对其表达模式进行分析,并验证对花期调控的功能,为进一步探究该基因在大白菜成花调控过程的作用机理奠定基础。【方法】运用RT-PCR克隆BrMLP328,并进行生物信息学分析;利用RT-qPCR测定该基因的相对表达量;构建过表达载体并通过蘸花法转化野生型拟南芥,比较T_(2)代植株与野生型的开花时间差异。【结果】BrMLP328的CDS全长为456 bp,编码151个氨基酸,蛋白相对分子质量为17493.82 Da,定位于细胞核。BrMLP328在大白菜茎中的表达量最高,根中次之,花蕾中最低;茎尖生长点中的表达量表现为春化后升高,之后在花芽分化阶段迅速下降,并维持在很低的水平。过表达BrMLP328的拟南芥开花时间比野生型延迟了1.46-3.09 d。【结论】从大白菜中克隆得到BrMLP328基因,其表达量在不同组织及不同成花阶段有所不同,该基因能够延迟开花。

鄂中地区油菜专用肥施用效果

为明确油菜(Brassica napus L.)专用肥对鄂中地区直播油菜产量的提升效果,于2019—2021年在湖北省沙洋县开展了连续2年的田间试验,设置了不施肥、常规施肥、宜施壮专用肥和洋丰专用肥4个施肥处理,考察各处理下成熟期油菜产量、地上部生物量、地上部养分含量、地上部养分积累量以及肥料偏生产力等的差异。结果表明,与不施肥对照相比,常规施肥和专用肥处理均能显著提高油菜子产量;与常规施肥相比,专用肥处理总养分投入减少了41.3%,而两者油菜子产量无明显差异。施肥显著增加了油菜地上部生物量,促进了油菜地上部对养分的吸收。油菜专用肥处理显著提高了肥料偏生产力,与常规施肥处理相比,宜施壮专用肥和洋丰专用肥处理平均肥料偏生产力在2019—2020年、2020—2021年分别提高了80.6%和68.2%。综上所述,油菜专用肥在保障油菜高产稳产的同时,提高了肥料利用率。

芜菁酸性多糖体内抗肿瘤活性研究

目的:探究芜菁酸性多糖一组分(BRAP-1)对非小细胞肺癌H226细胞荷瘤小鼠的影响。方法:将60只小鼠分为模型组(0.1 mL/10 g)、阳性药物顺铂组[3 mg/(kg·2 d)]、BRAP-1低剂量组[50 mg/(kg·d)]、BRAP-1中剂量组[100 mg/(kg·d)]和BRAP-1高剂量组[200 mg/(kg·d)]。试验期间观察小鼠肿瘤生长情况,计算抑瘤率、脏器指数;酶联免疫法检测各组小鼠血清中的白细胞介素18(IL-18)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;实时荧光定量核酸扩增法(q-PCR)、免疫印迹试验检测IL-18、IL-1β、受体相互作用蛋白1(RIP-1)、RIP3、混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)基因表达情况。结果:与模型组相比较,BRAP-1低、中剂量组抑瘤效果明显(P<0.05),阳性组和BRAP-1高剂量组抑瘤率效果显著(P<0.01);模型组与其他各组相比较,阳性组和BRAP-1高剂量组小鼠血清中IL-1β含量显著增加(P<0.01),IL-18、TNF-ɑ在阳性组中明显降低(P<0.05),BRAP-1各剂量组中显著增加(P<0.01);q-PCR、免疫印迹试验结果显示,与模型组相比IL-1β随给药剂量增加mRNA相对表达量减少(P<0.01),而IL-18、MLKL、RIP1、RIP3的mRNA及蛋白相对表达量增加(P<0.01)。结论:BRAP-1可以通过调节免疫细胞因子水平,上调坏死性凋亡相关蛋白MLKL、RIP1、RIP3抑制肺鳞癌H226细胞体内生长。

恰玛古异硫氰酸酯的酶解制备及抗宫颈癌活性

优化了恰玛古异硫氰酸酯(Brassica rapa L.isothiocyanate,BRIe)的外源酶解制备工艺,分析、评价了酶解产物的化学成分和抗宫颈癌活性。采用外源黑芥子酶对恰玛古硫代葡萄糖苷进行降解,通过单因素和正交优化实验确定了酶解法的最佳制备工艺:酶量为20μL、酶解温度70℃、pH 6.5、酶解时间2 h、抗坏血酸浓度为0.01 mg/g,在此条件下,异硫氰酸酯的提取率为11.13%;GC-MS鉴定分析所得酶解产物的化学成分有7种,分别为3-氨基-2-恶唑烷酮、2-恶唑烷硫酮、3-丁烯基异硫氰酸酯、2-苯乙基异硫氰酸酯、异硫氰酸异丙酯、异硫氰酸-2-苯乙酯。采用MTT法检测BRIe对宫颈癌Hela、Siha、U14细胞的增殖抑制活性,其中BRIe对Hela细胞的抑制作用最强,72 h IC_(50)为97.48μg/mL;细胞划痕实验显示BRIe抑制了Hela细胞的迁移,PI流式细胞染色显示BRIe将细胞周期阻滞在S期和G2/M期,Hochst 33258、Annexin V-FITC和PI染色表明BRIe诱导了Hela细胞凋亡。研究结果为开发利用恰玛古用于功能食品和抗宫颈癌药物提供了科学依据。