紫菜薹BrbHLH49基因克隆与功能分析

[目的]本文旨在研究紫菜薹BrbHLH49基因在花青素合成中的功能。[方法]以紫菜薹为材料,通过同源克隆获得BrbHLH49基因全长序列,并与其他物种中的同源序列进行进化树分析;构建pEarlyGate101-BrbHLH49-YFP载体并转化导入烟草叶片中,研究BrbHLH49蛋白的亚细胞定位;采用荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析BrbHLH49基因在紫菜薹和‘四九菜心’(‘CX-49’)不同组织中的表达情况,同时分析野生型和35S∶BrbHLH49-YFP转基因拟南芥中花青素合成相关基因的表达。[结果]BrbHLH49基因含有1431 bp开放阅读框,编码476个氨基酸,其编码的蛋白定位于细胞核中。在进化过程中BrbHLH49编码的氨基酸序列与甘蓝型油菜和野甘蓝(原变种)同源性最高,亲缘关系最近。RT-qPCR结果表明,紫菜薹的薹和叶中BrbHLH49相对表达量均显著高于‘CX-49’,且BrbHLH49转基因拟南芥植株中花青素合成相关基因的表达量显著高于野生型。[结论]BrbHLH49蛋白定位于细胞核中。BrbHLH49基因在紫菜薹的薹和叶中高表达,且拟南芥中过表达该基因能显著提高花青素的合成。

旋毛虫排泄分泌抗原p49基因的克隆

应用ＤＮＡ重组技术将编码旋毛虫肌幼虫４９ＫＤａ抗原的基因克隆于大肠杆菌中．设计特异的ＰＣＲ引物，用ＰＴ－ＰＣＲ技术直接从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中反转录并扩增出约１．１Ｋｂ的靶ＤＮＡ．用ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶解后将其克隆到质粒载体ｐＵＣ１９中，用Ｘ－ｇａｌ培养基筛选重组子．该重组子经相同的核酸内切酶水解获得约２．７Ｋｂ和１．１Ｋｂ两个片段，分别与ｐＵＣ１９和目的基因的大小相同，目的基因经序列分析并与文献报道的序列比较发现具有９７．８％的同源性．

SpltNPVp49基因的克隆和序列分析

根据新发现的杆状病毒凋亡抑制基因p4 9基因的序列设计了一对引物 ,以SpltNPV基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增获得了预期大小的约 1 3kb的DNA片段 ,将此片段克隆到pGEM T载体上并直接测序 .序列分析表明 ,该片段为SpltNPV完整的p4 9基因开放读码框 .与已知的杆状病毒p4 9基因的序列同源性为 87% ,与之对应的氨基酸序列的同源性高达 93% .它是首次从SpltNPV中克隆到的抑制细胞凋亡的基因 .

旋毛虫p49抗原基因克隆体外表达条件的研究

旋毛虫肌幼虫排泄一分泌（ES）抗原是用于旋毛虫病免疫检测的理想抗原，包括45kD、49kD和53kD三种主要的特异性蛋白成分。本文利用含有P49抗原基因克隆的重组表达质粒pGEX—p49，电转化大肠杆菌，获得DH5α／pGEX—p49转化子。SDS—PAGE电泳表明，含重组质粒pGEX—p49的大肠杆菌能表达-分子量为61kD的融合蛋白（p49／GST），Western—blot表明该融合蛋白能被鼠旋毛虫病阳性血清特异识别。为提高融合蛋白的表达量，本文对宿主菌诱导条件、诱导物浓度、诱导时细菌生长状态等条件与表达量的关系进行了研究。

旋毛虫p49基因的克隆、序列分析及表达

目的 获得旋毛虫排泄分泌抗原(excretory antigen,ES)p49基因的克隆、测序及表达。 方法 通过RT-PCR,从旋毛虫幼虫总RNA中扩增得到特异片段,利用TA克隆将PCR产物克隆入pUC-T载体中并进行测序及同源性比较,并定向克隆到表达载体pEG-4T-3中,转化感受态细胞,诱导表达。 结果 RT-PCR扩增得到p49基因,其核苷酸序列与已发表的p49基因序列一致;BLAST分析表明其与旋毛虫p49基因、43 KDa分泌性糖蛋白同源性均为99％。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,重组蛋白诱导表达在67 KDa处有一新蛋白带。 结论 提取旋毛虫幼虫总RNA,用RT-PCR方法克隆并表达了p49基因。

旋毛虫ES抗原P49基因的体外表达分析

目的克隆和表达旋毛虫ES抗原P49基因,并分析表达产物的免疫原性。方法以重组质粒pCDNA3.1-P49为模板,PCR扩增旋毛虫ES抗原P49基因,将扩增片段双酶切产物连接到质粒pEGFP-N1中,构建重组真核表达载体pEG-FP-N1-P49,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7。于转染24h后在荧光显微镜下观察发绿色荧光的转基因细胞;通过Western-blot分析证实P49基因表达产物的免疫原性。结果成功构建旋毛虫ES抗原P49基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-P49,并在COS-7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。结论成功获得了重组蛋白,并证实该融合蛋白具有免疫原性,其结果为研究其生物学功能奠定了基础。

猪旋毛虫不同发育时期虫体49ku ES抗原基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已登录的猪旋毛虫49 ku ES抗原基因序列设计了1对引物,用SDS裂解液配合蛋白酶K方法从猪旋毛虫不同发育时期(成囊前期幼虫、肌幼虫、成虫)虫体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增49 ku ES抗原基因,将目的基因定向克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希氏菌TG1。用PCR、限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行单、双酶切鉴定,阳性质粒的测序结果表明,成功克隆了猪旋毛虫不同发育时期虫体49 ku ES抗原基因。序列分析结果显示:49 kuES抗原基因大小为948 bp,基因的保守性很强,序列同源性比较高,不同发育时期之间的差异很小。

含伪狂犬病毒完整UL49基因及部分UL48基因片段的克隆与序列分析

以地高辛标记的伪狂犬病毒 (PRV)Ea株UL4 9.5基因片段为探针 ,同SalI、KpnI、BamHI消化的PRVEa株基因组DNA进行Southern杂交 ,确定SalI 2 .8kb、KpnI 17.0kb、BamHI 2 5 .0kb片段中含UL4 9基因。将SalI2 .8kb片段克隆到pUC119中 ,利用其中的BamHI进行亚克隆 ,获得重组质粒pUC2 .0。测定约 2 .0kb片段的全序列并进行序列分析 ,发现该片段包含UL5 0基因部分编码区 ,UL4 9.5基因和UL4 9基因的完整编码区 ,并且在UL4 9基因下游 ,还存在一段约 36 9个碱基的序列 ,经与人单纯疱疹病毒I型 (HSV 1)、牛单纯疱疹病毒I型 (BHV 1)的UL4 8基因进行比对 ,具有较高的同源性 ,推测为PRVUL4 8基因的部分编码区。

伪狂犬病病毒Bartha-K61株UL49基因的克隆和序列分析

根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRVBartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18_T载体中。重组质粒pMD_UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析。结果表明,重组质粒pMD_UL49含有PRVBartha_K61株UL49基因的编码区。同源性分析显示,PRVBartha_K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9%和94.1%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7%和87.2%。

马立克氏病病毒超强毒UL49基因siRNA表达质粒的构建与鉴定

以马立克氏病病毒超强毒(RB1B株)UL49为靶基因,利用计算机辅助设计UL49基因特异的siRNA,再定向克隆至pSilencerTM2.1U6neovector载体中构建siRNA表达重组体,转化DH5α菌株,提取质粒酶切鉴定后,进行测序分析,证实为所需序列。以上结果表明,针对马立克氏病超强毒UL49基因的siRNA表达质粒已构建成功。

本地毛形线虫49 Ku ES蛋白结构基因的分子克隆及原核表达

提取Trichinella nativa(T.nativa)肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码T.nativa 49 Ku ES蛋白的结构基因。基因克隆后测序,序列测定结果表明:目的基因TNPG长度为951 bp,核苷酸序列同已发表的Trichinella spiralis(T.spiralis)相应的序列P49同源性为97.68%,所推导的氨基酸序列同源性为95.24%。将目的基因TNPG插入到原核表达载体pET-30a的BamHⅠ酶切位点处,并转化到感受态表达菌中进行诱导表达。结果显示TNPG在原核表达菌BL-21中获得了高效表达,表达产物为40.8 Ku的融合蛋白,表达量达到菌体总蛋白的22.8%。通过Western blot分析,表达产物可以被小鼠T.nativa和T.spiralis阳性血清以及它们的中国地理株的小鼠血清特异性识别。

超强毒RB1B株马立克氏病UL49基因的克隆和序列分析

鸡马立克氏病病毒UL49基因编码的被膜蛋白VP22在病毒的复制和传播过程中具有非常重要的作用。根据已发表的MDV-lMd5株的序列,从马立克氏病超强毒RB1B株感染的鸡胚成纤维细胞中提取病毒基因组DNA,经PCR扩增UL49基因并克隆入pMD18TSimple载体。RB1B株UL49基因经核酸序列测定分析,全长为750碱基。将RB1B株与Md5株和GA株的UL49进行比较,发现马立克氏病病毒强毒株间的UL49基因高度同源,为利用RB1B的UL49基因作为基因治疗的靶序列奠定了理论基础。

牛疱疹病毒Ⅰ型u149(VP22)基因的序列分析及其表达

以牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-Ⅰ)国内地方分离株感染的细胞培养物制备PCR模板,扩增出大小约0.77kb的u149基因完整编码区片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体中,获得含u149基因的重组质粒pMD-VP22。采用双脱氧末端终止法进行序列测定,发现与国外Cooper株u149基因序列完全一致,说明u149基因相当保守。进一步将BHV-lu149完整编码区片段插入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C1中,获得分别与6xHis融合的原核表达质粒pET-28aVP22和与EGFP融合的真核表达质粒pEGFPVP22。将pET-28aVP22转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测发现在38kDa处有一条特异性的表达带。利用脂质体介导,将pEGFPVP22转染PK-15细胞,经G418加压筛选,获得稳定表达VP22的细胞克隆。在倒置荧光显微镜直接检测未固定的活细胞,发现pEGFPVP22转染细胞能发出很强的荧光并主要集中在细胞核中,而对照载体pEGFP-C1转染细胞的荧光分布于胞浆。

本地毛形线虫49kuES蛋白结构基因在昆虫细胞中的表达

根据BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统的供体质粒,设计表达引物,从克隆质粒上扩增本地毛形线虫(Trichinella nativa)49kuES结构蛋白基因TNPG,酶切后与供体质粒连接,在大肠杆菌中克隆,将克隆有外源基因的供体质粒转化DH10Bac感受态菌,该菌含有杆状病毒穿梭载体,供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下,通过转座而插入杆状病毒基因组中,筛选含有重组质粒的Bacmid DNA,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒。SDS-PAGE电泳显示表达蛋白为36ku的融合蛋白,Western blot检测表明表达的融合蛋白能够被小鼠旋毛虫的阳性血清识别。实验结果表明,本地毛形线虫的ES融合蛋白的制备将在诊断方法的建立和免疫研究方面具有很好的应用前景。

本地毛形线虫49 ku排泄分泌蛋白基因的克隆及序列分析

为了获得本地毛形线虫(Trichinella nativa)49 ku ES蛋白的结构基因,用Trizol提取T.nativa肌幼虫的总RNA,用RT-PCR方法扩增出了编码T.nativa49 ku排泄分泌蛋白的结构基因。将PCR产物与T载体连接并经过大肠埃希菌增殖后送检测序。序列测定表明,目的基因TNPG长度为951bp,核苷酸序列同已发表的T.spiralis相应的序列P49同源性为98.63%,所推导的氨基酸序列同源性为99.05%。为T.nativa49 ku ES蛋白结构基因的进一步研究打下基础。

旋毛虫肌幼虫分泌性蛋白P49基因的克隆与表达

通过设计、合成引物,以旋毛虫RNA为模板,用RT-PCR法扩增出旋毛虫P49序列,并进行了序列测定。将P49基因亚克隆至表达载体pET-28b中,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,作SDS-PAGE及Western blot分析。结果表明,PCR法扩增出P49序列,其大小约为960bp,将构建的重组质粒pGEM-P49进行序列测定表明其与Genbank中的P49序列具有高度的同源性。成功构建了重组表达载体pET-P49;SDS-PAGR及Western blot分析表明,表达产物分子量约为38kDa,约占菌体总蛋白的7％左右,且能被感染旋毛虫猪阳性血清所识别。

猪瘟病毒E2基因和牛疱疹病毒Ⅰ型UL49基因的共表达

为了探讨牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)UL49基因编码的膜蛋白VP22对猪瘟病毒E2基因表达水平的影响,构建了单独表达E2蛋白的pcDNA3.1-E2及融合表达E2-VP22的pcDNA3.1-E2-UL49。将pcDNA3.1-E2与pcDNA3.1-E2-UL49分别转染293 T细胞,间接免疫荧光试验结果显示,单独表达E2蛋白的细胞,其荧光主要固缩于核周,而融合表达E2-VP22蛋白的细胞在核周及细胞质内都有大量的荧光;Western-blot分析结果显示,VP22蛋白与E2蛋白都获得了表达,但融合了VP22蛋白的E2蛋白表达量要相对高一些(P<0.01),表明VP22蛋白可以促进E2蛋白的表达。

应用载体介导的RNAi技术抑制HCMV的UL49基因表达

为了研究RNA干涉抑制HCMV UL49基因的作用,以pLXSN(U6启动子)为模板通过两步PCR的方法扩增含U6启动子的siRNA表达片段,并通过TA克隆将siRNA表达片段克隆到pMD18-T载体构建成siRNA表达质粒,同时以人巨细胞病毒AD169病毒株基因组为模板PCR扩增UL49基因,将其克隆到pEGFP-N1构建融合质粒pEGFP-UL49。通过脂质体介导将siRNA表达质粒和pEGFP-UL49质粒共转染人宫颈癌细胞系HeLa,在荧光显微镜下观察RNA干涉结果。通过这种方法得到具有介导RNA干涉的siRNA片段,为UL49基因沉默研究提供技术基础。

反复自发性流产患者外周血CD14~＋细胞表面CD49b和淋巴细胞活化基因3表达水平降低

目的观测黏附分子CD49b和负性调节分子淋巴细胞活化基因3(LAG-3)在反复自发性流产(RSA)患者CD14+细胞上的表达。方法收集7例正常对照者和12例RSA患者外周血5 m L,分离外周血单个核细胞(PBMC)和血浆,流式细胞术检测PBMC中CD14+细胞表面CD49b和LAG-3的表达;ELISA检测血浆中细胞因子白细胞介素10(IL-10)和转化生长因子β(TGF-β)的水平。结果 RSA患者外周血中,单核细胞的比例与正常对照组相比无显著性差异;CD14+CD49b+、CD14+LAG-3+、CD14+CD49b+LAG-3+细胞的百分比均低于正常对照组。血浆中,TGF-β的水平低于正常对照组;IL-10的水平无显著差异。结论 RSA患者外周血CD14+细胞表面CD49b和LAG-3的表达和血浆中TGF-β的水平均显著降低。