Brn-4抗体对大鼠海马神经干细胞分化为神经元的影响

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备成年SD大鼠海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离、克隆和扩增的神经干细胞球分成6组:(1)切割组:加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(2)切割阻断组:在切割组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(3)正常组:加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(4)正常阻断组:在正常组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(5)空白组:加入单纯的DMEM/F12培养基;(6)空白阻断组:在空白组培养基中加入Brn-4多克隆抗体。培养后第14d对NSCs分化的神经元进行MAP-2免疫荧光检测,图像处理系统计数各组MAP-2阳性神经元数、处理胞体面积和细胞周长,STATA7.0软件进行统计分析。结果显示:各组以上三项形态学指标从优到劣的排列顺序为:切割组、正常组、切割阻断组、正常阻断组、空白组和空白阻断组。统计分析结果表明,除空白组与空白阻断组三项指标无显著性差异外,其余各组间差异均有显著性意义(P<0.05)。上述结果提示,Brn-4多克隆抗体在体外能部分地阻断切割海马伞侧海马提取液促进NSCs向神经元分化的作用,因而Brn-4在海马NSCs向神经元分化过程中可能发挥重要作用。

Brn-4在大鼠海马神经干细胞向神经元分化中的作用

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备切割海马伞侧和正常侧海马提取液,将鼠胚海马神经干细胞球分成3组:(1)切割组加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(2)正常组加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(3)对照组加入单纯的DMEM/F12无血清培养基。培养后第14d行Brn-4/MAP-2免疫荧光双标染色。在荧光显微镜下分别计数每个视野下Brn-4单标神经元和Brn-4/MAP-2双标神经元的数量,并测量双标神经元的胞体面积、细胞周长以及Brn-4的免疫荧光强度。用图像处理系统和Stata7.0软件对所得数据进行统计学分析。结果显示:Brn-4/MAP-2双标神经元数在切割组中较多、胞体较大、突起较丰富,且Brn-4的免疫荧光亦较强;正常组次之,对照组最差。上述数据经组间比较分析,3组间差异有显著性意义(P<0.01)。本研究结果提示Brn-4在海马神经干细胞向神经元分化过程中可能发挥重要作用。

Brn-4基因修饰骨髓间质干细胞移植对老年痴呆鼠学习记忆的影响

目的探讨Brn-4基因修饰大鼠骨髓间质干细胞(MSC)移植后对老年痴呆鼠学习记忆的影响。方法实验分为3组:正常组、模型组和移植组。以单侧切断穹隆海马伞(FF)建立老年性痴呆模型鼠;应用脂质体将表达载体转染到MSC中,荧光显微镜观察该Brn-4基因在MSC中的表达;将成功转染Brn-4基因修饰的MSC植入模型鼠尾静脉,4 w后行Y迷宫测试,并行免疫组化结合图像分析技术观察各组大鼠基底前脑p75阳性神经元数,同时采用电生理技术检测离体海马CA1区长时程增长效应(LTP)的诱导变化。结果 Brn-4基因在MSC中获得成功表达;免疫组化表明模型组大鼠p75阳性神经元数在内侧隔阂和斜角带较正常组明显下降(P<0.01);移植组p75阳性神经元数较模型组有改善(P<0.05)。离体海马CA1区移植组LTP在移植后6 d,12 d,30 d均较模型组有显著增强(P<0.05)。Y迷宫测试结果显示,大鼠的学习记忆能力与基底前脑p75阳性神经元数呈正相关。结论 Brn-4基因修饰MSC移植后提高了老年痴呆鼠学习记忆能力。

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达

本研究构建了真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4,并观察了其在大鼠骨髓间质干细胞(MSC)中的表达情况。提取新生鼠脑组织总RNA,利用RT-PCR的方法扩增Brn-4的基因片段,用基因重组技术将Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,测序及PCR进行鉴定;将重组质粒应用脂质体转染的方法转入MSC中,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达。经酶切及DNA测序结果证实pEGFP-Brn-4表达质粒的DNA序列完全正确,将此质粒转染MSC后Brn-4基因获得表达。研究结果提示成功构建真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4,且Brn-4基因可在MSC中表达,为后续探讨Brn-4修饰的MSC治疗老年痴呆的可行性奠定了基础。

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建及其在神经干细胞中的表达

目的构建神经发育转录因子Brn-4基因真核表达重组质粒,研究Brn-4在神经干细胞(NSC)中的表达情况。方法从新生鼠脑组织提取总RNA,利用RT-PCR的方法获得编码鼠Brn-4的基因片段,应用基因重组技术,将鼠Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,应用脂质体转染NSC,荧光显微镜观察该Brn-4基因在NSC中的表达。结果限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子,Brn-4基因在NSC中获得表达。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4通过鉴定,结构正确;Brn-4基因可在NSC中表达,可作为后续研究老年性痴呆动物模型转基因实验的基因来源。

RT-PCR/Southern杂交法检测穹窿海马伞切割大鼠海马Brn-4 mRNA的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法:42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割穹窿海马伞后1、3、7、14、21及28d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用RT-PCR/Southern杂交方法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA的表达变化。结果:海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3d开始升高,14d达到最高水平,随后下降,28d左右恢复至正常水平。结论:切割穹窿海马伞后海马内Brn-4mRNA表达明显上调,可能与促进海马内移植的或自体的神经干细胞向神经元分化有关。

穹窿海马伞切割大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化

目的探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割海马伞后1、3、7、14、21及28 d组。取各组大鼠的海马组织,提取总RNA,采用半定量RT-PCR法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA表达水平的变化。结果海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3 d开始升高,14 d达到最高水平,随后下降,28 d左右恢复至正常水平。结论切割穹窿海马伞后海马内Brn-4 mRNA表达明显上调,可能与促进神经干细胞更多地向神经元和AChE阳性神经元分化有关。

Brn-4在偏侧帕金森病大鼠模型纹状体中的表达变化

目的:探讨Brn-4在偏侧帕金森病大鼠模型纹状体中的表达变化。方法:用6-OHDA注入80只SD大鼠右侧前脑内侧束(medialforebrainbundle,MFB),行为学检测得成功PD模型48只,随机分成7d、14d、21d、28d4组,每组各12只。每组中的6只动物和6只正常对照大鼠的纹状体进行Brn-4Westernblot检测;另6只动物的纹状体进行Brn-4免疫组化染色。结果:Westernblot检测发现Brn-4的相对表达量(Brn-4/β-actin)正常对照组为0.123±0.02,7d组为0.538±0.04,14d组为0.192±0.05,21d组为0.122±0.02,28d组为0.084±0.02;而模型侧/正常侧纹状体Brn-4阳性细胞的比值7d、14d、21d和28d组分别为1.560±0.14,0.855±0.15,0.638±0.11和0.369±0.10。结论:PD大鼠模型纹状体中Brn-4蛋白于前脑内侧束注射6-OHDA后7d表达量急剧增高,而14d后则急剧下降,到28d时已低于正常水平。

切割穹窿海马伞大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化——原位杂交法

目的探讨大鼠穹隆海马伞切割侧与正常侧海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法切割大鼠右侧穹窿海马伞,切割后14d制备海马冰冻切片,用体外转录法制备地高辛标记的Brn-4 RNA探针进行原位杂交。每只动物随机计数3张切片切割侧和正常侧Brn-4 mRNA的阳性细胞,测定其吸光度(A)值,进行配对t检验分析。结果切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层均见Brn-4 mRNA阳性细胞,两侧细胞数无明显差异,但切割侧阳性细胞平均吸光度值较正常侧明显增加(P<0.01);而在齿状回门区和颗粒下层,切割侧Brn-4 mRNA阳性细胞数和平均吸光度值均较正常侧升高(均P<0.01)。结论穹窿海马伞切割侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层细胞中Brn-4 mRNA的表达量明显增强,而在齿状回门区和颗粒下层中,其阳性细胞数和表达量均较正常侧明显升高。结合本课题组以往的工作,提示切割穹窿海马伞后,海马中Brn-4 mRNA表达的增高可能与促进其中的神经干细胞向神经元分化有关。

大鼠海马神经干细胞Brn-4基因的特异性siRNA研究

目的筛选出高效针对大鼠海马神经干细胞Brn-4基因沉默的特异性siRNA。方法设计4对抑制Brn-4基因表达的特异性siRNA序列,通过脂质体转染入体外培养的大鼠海马神经干细胞中,采用RT-PCR和免疫荧光检测转染细胞Brn-4基因的表达,筛选出沉默Brn-4基因最为有效的siRNA序列,并优化其转染条件。结果4对siRNA不同程度地阻断了海马神经干细胞Brn-4基因的表达,阻断效率最高的1^# siRNA最适转染剂浓度为0.5μmol/L,最佳转染时长为48 h。结论应用1^# siRNA可以高效率地沉默大鼠海马神经干细胞Brn-4基因的表达。

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建与鉴定

目的构建神经同源盒基因Brn-4真核表达重组质粒。方法从新生SD大鼠脑组织提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法扩增编码鼠Brn-4的基因片段,应用基因重组技术将鼠Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,经BamHI、EcoRⅠ双酶切和单酶切证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得鼠Brn-4的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4通过鉴定,结构正确,为后续研究在神经干细胞中表达及其体内研究奠定了基础。