河南温县蚕豆萎蔫病毒2的鉴定与多样性分析

蚕豆萎蔫病毒2(broad bean wilt virus 2,BBWV2)属豇豆花叶病毒科蚕豆病毒属。2019年7月从河南温县采集20株具有褪绿和皱缩等典型病毒病症状的地黄,采用PCR技术从cDNA中扩增目的片段,有13株样品扩增出与预期大小相符的目的条带,检出率为65%;并通过克隆测序获得BBWV2 CP序列,将其与GenBank中其他48个BBWV2分离物进行序列分析,结果显示有75.4%~82.95%的一致率。系统发育分析表明,BBWV2可分为3个组,其中河南温县BBWV2地黄分离物(No.2279841-China-R.glutinosa-11)位于第Ⅲ组。

蚕豆萎蔫病毒2号分离物侵染对蚕豆叶片光合活性和叶绿体超微结构的影响

研究了受蚕豆萎蔫病毒2号(Broadbeanwiltvirus2,BBWV2)中国分离物B935和欧洲分离物PV131侵染的蚕豆(Vicicafaba)叶片光合特性、叶绿素荧光诱导动力学参数和叶绿体超微结构变化。感病蚕豆叶绿素含量减少,叶绿素a/b比逐步降低;光合气体交换参数Pn值和Gs值降低,Ci值升高;叶绿素荧光诱导动力学参数Fv/Fm、Fv'/Fm'、ΦPSII、qP值均有不同程度降低,NPQ值升高;光合器结构遭到不同程度的破坏,B935侵染后叶绿体发育不良,片层结构疏松,PV131侵染后叶绿体肿胀变圆,片层结构疏松瓦解。与B935相比,PV131侵染对以上各参数的变化有更大影响,且对叶绿体的破坏更为严重。实验结果表明BBWV2不同分离物对光系统II(PSII)的抑制作用与光合器受损程度相关。

蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制

用蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）提纯病毒粒子免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，用纯化的ＢＢＷＶ病毒对杂交瘤细胞及时筛选，阳性孔经三次有限稀释法克隆，成功获得２株ＢＢ－ＷＶ特异性单克隆抗体的细胞株，分别命名为４Ｄ１１，３Ｇ１２．２株单抗腹水间接ＥＬＩＳＡ效价高达１∶６４００００，抗体类型均为ＩｇＧ１，经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ分析表明，２株单抗均是针对ＢＢＷＶ４４．７ｋＤ的外壳蛋白大亚基的特异性抗体．

侵染大豆的蚕豆萎蔫病毒研究

从杭州市郊的大豆病株上获得一病毒分离物Ｓ１，温室人工摩擦接种７科１６种植物，Ｓ１能侵染其中的５科１４种植物．Ｓ１能由桃蚜、豆蚜以非持久性方式传毒，该分离物的钝化温度为５０～５５℃，稀释限点为１０－３～１０－４，体外保毒期为３～４ｄ（２５℃）．用昆诺藜作繁殖寄主可提到大量球状病毒粒子，ｄ为２５～３０ｎｍ．病毒外壳蛋白主要由两种亚基构成，Ｍｒ分别为４４．７×１０３和２１．９×１０３，病毒基因组由两条ＲＮＡ分子组成，大小分别为６．２ｋｂ与３．８ｋｂ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果显示３．８ｋｂＲＮＡ与ＢＢＷＶ２蚕豆分离物ＲＮＡ２ｃＤＮＡ有明显杂交反应．病毒粒子电泳后产生相似于豇豆花叶病毒科的快、慢两个电泳型．琼脂双扩散试验中，Ｓ１和ＢＢＷＶ２均能与蚕豆萎蔫病毒２（ＢＢＷＶ２）抗血清形成明显沉淀线，且沉淀线互相融合，Ｗｅｓｔｅｒｎ检测亦表明，此分离物的大小亚基均可与ＢＢＷＶ２抗血清反应．根据以上特性，Ｓ１分离物被鉴定为ＢＢＷＶ２．

与蚕豆萎蔫病毒2号胞间运动和长距离转运相关的寄主细胞超微结构研究

电镜超微结构观察和免疫金标记显示:受蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV 2)中国分离物B935侵染的豌豆(Pisum sativum)和蚕豆(Vicia faba)叶细胞中膜结构增生,形成膜结构增生区,病毒以结晶体和管状体形式存在于细胞质中。在病变早期,叶肉细胞的胞间连丝处连接有小管结构,病毒样颗粒呈纵列排在小管中,穿越胞间连丝的小管能被BBWV 2的金标记抗体特异性标记。维管束组织的薄壁细胞、伴胞及转移细胞内存在膜增生区及病毒管状体,在筛管壁附近存在的病毒样颗粒能被BBWV 2金标记抗体特异性标记。实验结果表明BBWV 2胞间运动形式与豇豆花叶病毒(CPMV)相似,以完整粒子通过在胞间连丝处形成的小管结构穿越胞间连丝;细胞质中存在的直径160nm管状体只是一种病毒聚集体,与胞间运动无直接关系;该病毒在筛管中可能也是以完整粒子形式进行长距离转运的。

单克隆抗体夹心ELISA检测蚕豆萎蔫病毒研究

利用 ２ 株特异性单抗，建立了检测蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）的灵敏度高、特异性好的单抗夹心ＥＬＩＳＡ 方法⒚经测定，ＭｃＡｂ 最适包被浓度为０４ μｇ／ｍ Ｌ，ＨＲＰＭｃＡｂ 最佳工作浓度为１∶２ ０００，该方法最小检出浓度为０１６ μｇ／ｍ Ｌ，与几种常见的病毒无交叉反应⒚对杭州地区的 １４０ 多个样本进行了检测，发现蚕豆、豌豆中ＢＢＷ Ｖ 的阳性率达 ８０％

蚕豆萎蔫病毒纯化和病毒蛋白质及RNA组份分析

属蚕豆萎蔫病毒（ＥＢＷＶ）血清Ⅱ型的分离物Ｂ－９３４接种昆诺黎，采收的病叶先用含蔗糖的高浓度磷酸钾盐缓冲液，后用ＴｒｉｔｏｎＸ－１００处理，成功地提取到了大量病毒粒子，提纯病毒得率为１３４ｍｇ／ｋｇ病叶。提纯病毒在电镜下可观察到大量球状病毒粒子，直径约２５ｎｍ。提纯的ＢＢＷＶ经甘油梯度超离心后可观察到３个组份，分别称Ｔ、Ｂ和Ｍ组份，其中Ｔ为空壳蛋白，Ｂ和Ｍ为核蛋白。各组份经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定，证明其外壳蛋白均由两条多肽链组成，分子量分别为４２．５ｋＤ和２１．２ｋＤ。病毒颗粒中ＲＮＡ组份分析及病叶组织中ｄｓＲＮＡ分析均表明，ＢＢＷＶ病毒基因组由两条单链ＲＮＡ分子组成，分子量约为２．２×１０￣６和１．５×１０￣６。电泳分析表明，ＢＢＷＶ病毒粒子电泳后产生类似于豇豆花叶病毒组（Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ）的两个电泳型。

侵染豌豆和蚕豆的蚕豆萎蔫病毒研究

从浙江省豌豆和蚕豆病株上获得两个病毒分离物，编号为Ｐ－９３５和Ｂ－９３４．人工摩擦接种６科１９种植物，Ｐ－９３５能侵染４科１３种植物，Ｂ－９３４能侵染４科１４种植物，除菜豆外，它们在这些植物上的症状十分相似。Ｐ－９３５和Ｂ－９３４的钝化温度为５０－５５℃，稀释限点为１０￣（－３）－１０￣（－４），体外保毒期分别为５天和４天。两个分离物均能由桃蚜以非持久性方式传毒，用昆诺藜作繁殖寄主均提取到了大量病毒粒子，提纯病毒粒子球形，平均直径２５ｎｍ。病毒外壳蛋白均由两种亚基组成，分子量分别为４２．５ｋＤ和２１．２ｋＤ，感病叶片组织中观察到了无定形的泡状内含体，在琼脂双扩散试验中，Ｐ－９３５和Ｂ－９３４均能与蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）抗血清（血清型Ⅱ）形成清晰沉淀线。根据以上特性，Ｐ－９３５和Ｂ－９３４均被鉴定为蚕豆萎蔫病毒，且都属血清型Ⅱ．初步调查表明杭州郊区豌豆病毒病均由ＢＢＷＶ引起，蚕豆病毒病主要有ＢＢＷＶ和黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）。

蚕豆萎蔫病毒2号山西分离株的全基因组序列测定与分析

本试验在生物学接种的基础上,利用非序列依赖性PCR扩增（sequence-independent amplification,SIA）对感病青椒（Capsicum annuum）进行了分子鉴定.序列测定及分析发现,侵染青椒的病毒为蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV2）.为明确BBWV2青椒分离物（BBWV2-Ca）的分类地位,对BBWV2-Ca的全基因组序列进行了分段克隆、序列测定和分析.BBWV2-Ca RNA1全长5 929 bp,含有1个ORF.BBWV2-Ca RNA2全长3 559 bp,含有1个ORF,编码3种蛋白：VP53/VP37、外壳蛋白大亚基（large coat protein,LCP）和外壳蛋白小亚基（small coat protein,SCP）.全序列核苷酸同源性分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在77.9%-93.7%之间;RNA2与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在80.2%-93.8%之间.全序列系统进化分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2-XJ14-3以及BBWV2-RP3株系聚为一簇,亲缘关系最近;RNA2与BBWV2-Am形成一个独立分支,亲缘关系最近.

我国太子参主产区病毒病发生情况调查

为调查我国太子参主产区病毒病发生情况,使用RT-PCR法对采自福建省柘荣县,贵州省施秉县、丹寨县和安徽省宣城市的71份具有典型病毒病症状的太子参样品进行检测,并根据CP氨基酸序列对不同地区病毒进行系统进化分析。RT-PCR结果显示,65份样品检出病毒,检出率为91.55%,其中,56份样品检出芜菁花叶病毒Turnip mosaic virus(TuMV),49份样品检出蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2(BBWV2),9份样品检测出黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV),检出率分别为78.87%、69.01%和12.68%。未检测到烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus(TMV)。序列和系统发育进化分析显示,本研究获得的TuMV、BBWV2和CMV与NCBI数据库中的序列相似度较高,核苷酸相似度分别为98.05%~98.98%、93.61%~94.25%和98.02%~99.17%,氨基酸序列相似度分别为:96.14%~97.47%、97.33%~98.50%和98.00%~100%,分别属于World-B组、Ⅰ-a亚组和Ⅱ组。

太子参(PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA)病毒病病原鉴定

太子参(Pseudostellaria heterophylla)是我国传统的中药材之一,其病毒病十分严重,田间发病率和种根带毒率可达100％,平均90％左右。自太子参病株分离得到的T-17、T-32、T-69和T-01四个病毒分离物,经鉴定,它们分别为芜菁花叶病毒(Turnip mosaicvirus,TuMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、蚕豆萎蔫病毒(Broad beanwilt virus,BBWV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)。其中以TuMV分布最广,为害最重,是太子参病毒病的主要病原。

侵染加工番茄的BBWV2的分子鉴定及田间检测

利用蚕豆病毒属的兼并引物对23个加工番茄病株进行RT-PCR检测,其中19株检测出被该属病毒侵染。从中选取4个病株的RT-PCR产物进行克隆和测序,将所得序列经过基因库检索发现,4个序列均与蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)基因组RNA1的序列同源性最高。然后对病毒分离物XJ14-1基因组进行进一步的克隆和测序,获得RNA1组分3659个核苷酸,RNA2组分1300个核苷酸,序列比对结果显示,它们与BBWV2的RNA1和RNA2具有高的序列同源性,分别为76.6%~94%和76.9%~94.1%,而与BBWV1的RNA1和RNA2的序列相似性都很低。因此分子鉴定结果表明,新疆加工番茄受到BBWV2的侵染。利用BBWV2的单克隆抗体对田间不同品种(品系)加工番茄病株进行ELISA检测,结果显示田间病株带毒率达到53.3%,并且供试20品种(品系)均可被BBWV2侵染,该数据表明,BBWV2在田间发生普遍。

蚕豆萎蔫病毒2号VP37蛋白在BY-2细胞内的定位

将绿色荧光蛋白(GFP)连接于蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2,BBWV-2)VP37蛋白的N-端,构建融合基因GFP-VP37,用农杆菌法在BY-2悬浮细胞内进行表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的分布。结果显示:GFP-VP37主要定位于细胞核的周围呈网络状,并在细胞边缘形成点状结构;ER-tracker标记显示VP37在细胞内与内质网共定位;电镜免疫金标记显示VP37蛋白主要定位在细胞质中;用BFA处理转染细胞后,VP37在细胞质及细胞边缘的定位受到抑制。推测内质网参与VP37的细胞内转运和分布。

蚕豆萎蔫病毒两个分离物的比较研究

作者对蚕豆萎蔫病毒的两个分离物Ｂ９３５和Ｐ１５８的部分特征作了比较研究；从病毒粒子形态、血清学关系、病毒衣壳蛋白组分和分子量以及病毒核酸组分和分子量这些特征看，Ｂ９３５和Ｐ１５８基本相似。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ结果表明，Ｂ９３５和Ｐ１５８基因组具有同源性，但其同源性不高，这意味着蚕豆萎蔫病毒种内基因组上可能存在着较大的差异。

侵染大豆、豇豆和蚕豆的蚕豆萎蔫病毒生物学性状和血清学的比较研究

蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)能危害多种农作物,在南京地区也普遍存在。值得注意的是,蚕豆萎蔫病毒与其它病毒在几种豆科植物上的混合感染常有发生,往往造成严重症状,病株严重减产或根本不能结实。我国曾从豇豆和菠菜上分离到BBWV。我们在1983～1984年先后从南京郊区发生病毒病的大豆。

蚕豆萎蔫病毒──新疆番茄分离株的鉴定

在新疆番茄斑驳病株上分离出一种球状病毒，回接到番茄上产生斑驳症状。病毒粒体为２０面体，平均直径２５ｎｍ。经汁液摩擦接种可感染昆诺阿藜、苋色藜、蚕豆、番茄等１８种植物，不感染菜豆、豇豆、豌豆、六叶茄、黄瓜等。可由桃蚜传毒。在琼脂双扩散试验中，能与蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）抗血清产生明显的沉淀线，与豇豆花叶病毒（ＣｐＭＶ）、黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）抗血清均不发生反应。纯化病毒紫外扫描呈典型的核蛋白吸收叫线，病毒衣壳蛋白由两种蛋白亚基构成，其分子量分别为４５９００和２０４００道尔顿，由１８种氨基酸约２５５个氨基酸残基组成。病毒核酸是双组份的，它们的分子量为１３２００００和２３４００００道尔顿。根据上述结果认为该病毒是蚕豆萎蔫病毒侵染番茄的一个株系。

蚕豆萎焉病毒2感染豌豆叶细胞后引起的线粒体增生和聚集

应用超薄切片和免疫金标记电镜技术,结合体视学分析研究了受蚕豆萎焉病毒2(BBWV 2) 中国分离物B935侵染的豌豆(Pisum sativum)叶细胞中线粒体的异常变化。结果表明,感病细胞线粒体增生并聚集于细胞质的膜增生区周围,体积增大,形状畸变,一些线粒体内含有类结晶包涵体。病叶细胞与健康对照之间线粒体的体积密度(VV)、表面积密度(SV)、数密度(NV)等参数存在显著差异(P<0.01),而形状因子(PE)、周长指数(CI)、比表面积(RSV)等参数随不同病变阶段而有变化。在线粒体周围及线粒体之间的网格结构可被BBWV 2金标记抗体特异性标记．推断为正在组装的病毒粒子。子代病毒形成结晶体和管状体,有高密度的免疫金颗粒标记。上述研究结果提示BBWV 2 引起的细胞线粒体异常变化与病毒复制组装有关,聚集线粒体的外膜粘连面可能是病毒粒子组装部位,一些线粒体内的类结晶包涵体可能代表了某种蛋白质异常积累。

免疫胶体金标记定位昆诺藜中的胼胝质和胼胝质降解酶

运用免疫胶体金技术研究了感染蚕豆萎蔫病毒2号以及健康昆诺藜细胞中胼胝质和胼胝质降解酶的分布情况。电镜观察发现胶体金特异性标记在含有VP37小管的胞间运动通道周围,其余区域感病和健康细胞的胼胝质及胼胝质降解酶分布差别不大,胼胝质主要分布于细胞间隙的大块电子致密物质以及细胞壁结构发生较大变化的区域,胼胝质降解酶主要分布于筛板、维管束细胞紧贴细胞壁区域的大块电子致密物质上,在细胞壁结构发生较大改变的区域也有胼胝质降解酶的分布。推测胼胝质在昆诺藜细胞中的积累和降解可能与细胞壁结构成分改变有关。

南京芹菜病毒病毒源鉴定

1987～1989年从南京郊区采集130余份感染病毒的西洋芹菜和本地芹菜样本,通过寄主及症状的测定、蚜虫传毒试验、体外抗性测定、提纯的病毒粒体形态观察及血清学试验,鉴定出黄瓜花叶病毒(CMV)、线虫传多角体病毒组成员(Nepovirus member)、欧洲防风花叶病毒(PaMV)、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)和烟草花叶病毒(TMV)。其中CMV为侵染芹菜的优势病毒,占72.28％,CMV与BBWV和TMV复合侵染占16.83％。

侵染勿忘我花卉的蚕豆萎蔫病毒的鉴定

从勿忘我（Ｍｙｏｓｏｔｉｓｓｉｌｖａｔｉｃａ）上采集到１病株，接种昆诺阿藜，接种叶褪绿斑，系统顶枯，最后整株枯死。蚕豆接种叶呈黑色坏死斑，主茎变褐、全株萎蔫。矮牵牛接种叶褪绿斑，系统花叶。用诱捕修饰法制片，观察到病毒粒体球形，并在病毒粒体外面包被着一层抗体。