河南温县蚕豆萎蔫病毒2的鉴定与多样性分析

蚕豆萎蔫病毒2(broad bean wilt virus 2,BBWV2)属豇豆花叶病毒科蚕豆病毒属。2019年7月从河南温县采集20株具有褪绿和皱缩等典型病毒病症状的地黄,采用PCR技术从cDNA中扩增目的片段,有13株样品扩增出与预期大小相符的目的条带,检出率为65%;并通过克隆测序获得BBWV2 CP序列,将其与GenBank中其他48个BBWV2分离物进行序列分析,结果显示有75.4%~82.95%的一致率。系统发育分析表明,BBWV2可分为3个组,其中河南温县BBWV2地黄分离物(No.2279841-China-R.glutinosa-11)位于第Ⅲ组。

侵染加工番茄的BBWV2的分子鉴定及田间检测

利用蚕豆病毒属的兼并引物对23个加工番茄病株进行RT-PCR检测,其中19株检测出被该属病毒侵染。从中选取4个病株的RT-PCR产物进行克隆和测序,将所得序列经过基因库检索发现,4个序列均与蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2)基因组RNA1的序列同源性最高。然后对病毒分离物XJ14-1基因组进行进一步的克隆和测序,获得RNA1组分3659个核苷酸,RNA2组分1300个核苷酸,序列比对结果显示,它们与BBWV2的RNA1和RNA2具有高的序列同源性,分别为76.6%~94%和76.9%~94.1%,而与BBWV1的RNA1和RNA2的序列相似性都很低。因此分子鉴定结果表明,新疆加工番茄受到BBWV2的侵染。利用BBWV2的单克隆抗体对田间不同品种(品系)加工番茄病株进行ELISA检测,结果显示田间病株带毒率达到53.3%,并且供试20品种(品系)均可被BBWV2侵染,该数据表明,BBWV2在田间发生普遍。

太子参BBWV2和TuMV的巢式RT-PCR检测

为探求快速、灵敏的太子参脱毒检测技术,建立太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)和芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的巢式RT-PCR快速检测方法,根据GenBank数据库中这2种病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因核苷酸序列的保守区域分别设计2对简并引物,建立和优化巢式RT-PCR扩增体系,继而进行常规RT-PCR和巢式RT-PCR灵敏度的比较,并应用巢式RT-PCR对7份田间栽培太子参病样和4份脱毒苗样品进行检测。结果显示:BBWV2、TuMV的巢式引物最佳退火温度分别为60、62℃;采用巢式RT-PCR,这两种病毒样品cDNA原液在稀释10~5倍后仍能扩增出特异性条带,比常规RT-PCR的灵敏度至少高10倍。本研究建立的巢式RT-PCR检测方法可快速、稳定、准确地检测BBWV2和TuMV,且具有更高的灵敏度,更能满足太子参脱毒检测的需要。

蚕豆萎蔫病毒2号分离物侵染对蚕豆叶片光合活性和叶绿体超微结构的影响

研究了受蚕豆萎蔫病毒2号(Broadbeanwiltvirus2,BBWV2)中国分离物B935和欧洲分离物PV131侵染的蚕豆(Vicicafaba)叶片光合特性、叶绿素荧光诱导动力学参数和叶绿体超微结构变化。感病蚕豆叶绿素含量减少,叶绿素a/b比逐步降低;光合气体交换参数Pn值和Gs值降低,Ci值升高;叶绿素荧光诱导动力学参数Fv/Fm、Fv'/Fm'、ΦPSII、qP值均有不同程度降低,NPQ值升高;光合器结构遭到不同程度的破坏,B935侵染后叶绿体发育不良,片层结构疏松,PV131侵染后叶绿体肿胀变圆,片层结构疏松瓦解。与B935相比,PV131侵染对以上各参数的变化有更大影响,且对叶绿体的破坏更为严重。实验结果表明BBWV2不同分离物对光系统II(PSII)的抑制作用与光合器受损程度相关。

与蚕豆萎蔫病毒2号胞间运动和长距离转运相关的寄主细胞超微结构研究

电镜超微结构观察和免疫金标记显示:受蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2,BBWV 2)中国分离物B935侵染的豌豆(Pisum sativum)和蚕豆(Vicia faba)叶细胞中膜结构增生,形成膜结构增生区,病毒以结晶体和管状体形式存在于细胞质中。在病变早期,叶肉细胞的胞间连丝处连接有小管结构,病毒样颗粒呈纵列排在小管中,穿越胞间连丝的小管能被BBWV 2的金标记抗体特异性标记。维管束组织的薄壁细胞、伴胞及转移细胞内存在膜增生区及病毒管状体,在筛管壁附近存在的病毒样颗粒能被BBWV 2金标记抗体特异性标记。实验结果表明BBWV 2胞间运动形式与豇豆花叶病毒(CPMV)相似,以完整粒子通过在胞间连丝处形成的小管结构穿越胞间连丝;细胞质中存在的直径160nm管状体只是一种病毒聚集体,与胞间运动无直接关系;该病毒在筛管中可能也是以完整粒子形式进行长距离转运的。

蚕豆萎蔫病毒2号山西分离株的全基因组序列测定与分析

本试验在生物学接种的基础上,利用非序列依赖性PCR扩增（sequence-independent amplification,SIA）对感病青椒（Capsicum annuum）进行了分子鉴定.序列测定及分析发现,侵染青椒的病毒为蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV2）.为明确BBWV2青椒分离物（BBWV2-Ca）的分类地位,对BBWV2-Ca的全基因组序列进行了分段克隆、序列测定和分析.BBWV2-Ca RNA1全长5 929 bp,含有1个ORF.BBWV2-Ca RNA2全长3 559 bp,含有1个ORF,编码3种蛋白：VP53/VP37、外壳蛋白大亚基（large coat protein,LCP）和外壳蛋白小亚基（small coat protein,SCP）.全序列核苷酸同源性分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在77.9%-93.7%之间;RNA2与BBWV2其它分离物核苷酸同源性在80.2%-93.8%之间.全序列系统进化分析显示,BBWV2-Ca RNA1与BBWV2-XJ14-3以及BBWV2-RP3株系聚为一簇,亲缘关系最近;RNA2与BBWV2-Am形成一个独立分支,亲缘关系最近.

蚕豆萎蔫病毒2号VP37蛋白在BY-2细胞内的定位

将绿色荧光蛋白(GFP)连接于蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2,BBWV-2)VP37蛋白的N-端,构建融合基因GFP-VP37,用农杆菌法在BY-2悬浮细胞内进行表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的分布。结果显示:GFP-VP37主要定位于细胞核的周围呈网络状,并在细胞边缘形成点状结构;ER-tracker标记显示VP37在细胞内与内质网共定位;电镜免疫金标记显示VP37蛋白主要定位在细胞质中;用BFA处理转染细胞后,VP37在细胞质及细胞边缘的定位受到抑制。推测内质网参与VP37的细胞内转运和分布。

蚕豆萎焉病毒2感染豌豆叶细胞后引起的线粒体增生和聚集

应用超薄切片和免疫金标记电镜技术,结合体视学分析研究了受蚕豆萎焉病毒2(BBWV 2) 中国分离物B935侵染的豌豆(Pisum sativum)叶细胞中线粒体的异常变化。结果表明,感病细胞线粒体增生并聚集于细胞质的膜增生区周围,体积增大,形状畸变,一些线粒体内含有类结晶包涵体。病叶细胞与健康对照之间线粒体的体积密度(VV)、表面积密度(SV)、数密度(NV)等参数存在显著差异(P<0.01),而形状因子(PE)、周长指数(CI)、比表面积(RSV)等参数随不同病变阶段而有变化。在线粒体周围及线粒体之间的网格结构可被BBWV 2金标记抗体特异性标记．推断为正在组装的病毒粒子。子代病毒形成结晶体和管状体,有高密度的免疫金颗粒标记。上述研究结果提示BBWV 2 引起的细胞线粒体异常变化与病毒复制组装有关,聚集线粒体的外膜粘连面可能是病毒粒子组装部位,一些线粒体内的类结晶包涵体可能代表了某种蛋白质异常积累。

蚕豆萎蔫病毒2号板蓝根分离株全基因组序列测定与分析

板蓝根(Isatidis Radix)病毒病害的发生已对其产量和品质造成了严重影响。因此,建立一套灵敏、快速、有效的板蓝根病毒病害检测手段十分重要。本研究利用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)等技术对感病板蓝根进行鉴定,确定其被蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus 2, BBWV2)所侵染。为明确BBWV2板蓝根分离物(BBWV2-IR)的进化关系,对其全基因组进行序列扩增与分析,获得其RNA1序列全长为5 955 bp,RNA2序列全长为3 602 bp,分别编码由1 870和1 064个氨基酸组成的多聚蛋白质。序列比对发现,BBWV2-IR RNA1与BBWV2-Am分离物的同源性最高,RNA2与BBWV2-SN分离物的同源性最高。全基因组变异情况分析表明,BBWV2-IR RNA1和RNA2分别与其同源性最高的株系存在多个氨基酸变异位点。系统进化分析表明,BBWV2-IR RNA1与BBWV2-Am RNA1聚为一簇,RNA2与BBWV2-SN RNA2聚为一簇,亲缘性最近。本研究获得了BBWV2板蓝根分离株的全基因组序列,并明确其在进化过程中的地位和区域变化情况,为进一步研究BBWV2-IR致病性变异提供一定的理论基础。

蚕豆萎蔫病毒2号安徽分离物全基因组序列测定与分析

利用酶联免疫和RT-PCR技术对采自安徽地区的蚕豆病株进行检测,确定其病原为蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2(BBWV2)。为明确BBWV2安徽分离物(BBWV2-AH)的分类地位,克隆了该分离物的全基因组序列,分析了其基因组特征。结果表明,BBWV2-AH RNA1全长为5 944 bp(GenBank登录号:KY606992),含有1个ORF;BBWV2-AH RNA2全长3 587bp(GenBank登录号:KY606993),含有1个ORF。全序列核苷酸和氨基酸相似性分析显示,BBWV2-AH RNA1与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为78.4%~96%和87.1%~99%;BBWV2-AH RNA2与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为76.8%~95.5%和88.2%~98.3%。全基因组核苷酸序列系统发育分析显示,BBWV2-AH RNA1与中国的BBWV2-Hunan RNA1的亲缘关系最近,而BBWV2-AH RNA2与韩国的多个分离物聚集在一起,再与中国的分离物BBWV2-B935形成一个分支。

蚕豆萎蔫病毒2号辽宁藜分离物的鉴定

2016年6月在辽宁省沈阳市采集到表现为疑似蚕豆萎蔫病毒2号所致皱缩症状的藜病叶样品。选取明显病症样品送华大基因进行RNA提取和质量检测,得到OD260/280为2.09,OD260/230为1.85,RIN值为7以及28S/18S为1.3的合格样品。利用该RNA样品构建了去除rRNA的转录组库,经BGISEQ-500平台测序得到11.83 Gb数据。数据经过CLC Genomics Workbench(CLC bio v10.0,Aarhus,Denmark)软件过滤和拼接后获得长度为5945和3550的2个contigs,其经BLASTn和BLASTx比对显示与BBWV2的高度同源。基于此contigs序列,设计7对引物对病毒样品进行RT-PCR扩增,得到5891个核苷酸的RNA1序列(GenBank登录号为MN786954),3549个核苷酸的RNA2序列(GenBank登录号为MN786955)。基于该病毒cp基因的氨基酸序列进行同源性分析,发现该病毒与韩国益母草分离物BBWV2-[SK:Leonurus sibiricus](KM076649)同源性最高,为96.5%。根据Fabavirus的分类标准,认为该病毒是BBWV2的辽宁分离物。这是国际上首次报道藜科植物感染BBWV2。

侵染花叶青木的病毒种类鉴定及其基因序列分析

【目的】探明采自云南和海南表现为黄化、皱缩等表型的花叶青木病毒种类。【方法】首先,利用转录组测序技术对来自云南省昆明市的花叶青木样品进行检测;然后,根据转录组测序结果,采用RT-PCR对采自云南省昆明市和海南省海口市的73份花叶青木样品开展转录组测序结果中发现的病毒种类检测验证,并扩增获得相关病毒基因片段,对这些病毒的基因序列进行比对分析。【结果】转录组测序结果发现,送测的花叶青木样品中含有蚕豆萎蔫病毒2号(broad bean wilt virus 2,BBWV2)、菜豆黄花叶病毒(bean yellow mosaic virus,BYMV)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)、豌豆耳突花叶病毒1号(pea enation mosaic virus 1,PEMV-1)和豌豆耳突花叶病毒2号(pea enation mosaic virus 2,PEMV-2)5种病毒的侵染。但随后对来自云南和海南的73份花叶青木样品的RT-PCR验证中,只检测到BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-24种病毒。其中,云南和海南的样品中均能检测到BBWV2,总检出率为11.0%;而BYMV、CMV和PEMV-2仅在云南的样品中被检测到,检出率分别为5.5%、1.4%和1.4%。从两地采集的花叶青木样品中既未发现PEMV-1的侵染,也未发现BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2的复合侵染。为了进一步分析BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2花叶青木分离物与来自其他寄主植物相关病毒分离物的分子变异,选取检测到上述4种病毒的样品,分别对BBWV2、BYMV和CMV 3种病毒的cp及PEMV-2的RdRp序列进行扩增,并对扩增获得的BBWV2490 nt的small cp(GenBank登录号:OQ137565、OQ137566)、BYMV 499 nt的cp核心区域(GenBank登录号:OQ137568)、CMV 880 nt的cp(GenBank登录号:OQ137567)和PEMV-2800nt的RdRp核心区域序列(GenBank登录号:OQ137569)进行分析。序列比对分析结果表明,BBWV2云南与海南花叶青木分离物间存在85.9%的核苷酸序列一致性,二者与GenBank中其他BBWV2分离物分别存在79.8%—94.5%和80.2%—92.0%的核苷酸序列一致性;BYMV、CMV和PEMV-2云南花叶青木分离物与GenBank中相应病毒的核苷酸序列一致性分别为79.8%—99.0%、71.5%—99.4%和84.9%—98.0%。利用以上病毒相应基因核苷酸序列构建系统发育树,发现BBWV2云南和海南花叶青木分离物分别属于I组中的a亚组和b亚组;BYMV云南花叶青木分离物与伊朗(GenBank登录号:MN241051,MN241060)和伊拉克(GenBank登录号:JQ026005)蚕豆分离物具有较近的亲缘关系;CMV云南花叶青木分离物属于I组中的IB亚组,但与IB亚组的其他成员具有较远的亲缘关系;PEMV-2云南花叶青木分离物与云南豌豆分离物亲缘关系最近并聚为一组,但与其他分离物存在较远的亲缘关系。【结论】首次报道了花叶青木被病毒感染,同时也是BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2在花叶青木乃至桃叶珊瑚属植物上的首次报道,BBWV2、BYMV、CMV和PEMV-2花叶青木分离物与来自其他植物的相关病毒分离物存在较大的分子变异。

茄子斑驳皱缩病毒病病原物的鉴定及分子进化分析

为了鉴定引起茄子斑驳皱缩病毒病的病原物,利用siRNA高通量测序技术(Small interfering RNA,siRNA),结合生物信息学的方法发现2个表现斑驳和皱缩的茄子样品中存在蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus,BBWV2)、葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)。采用RT-PCR技术对该结果进行验证,2个样品中均检测到BBWV2和TMV,未检测到GVA。通过对BBWV2外壳蛋白(Large coat protein,LCP)大亚基基因进行测序和分子进化分析,获得了2条1126 bp的BBWV2 LCP基因片段,2条BBWV2 LCP基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列一致性分别为99.6%和99.3%;与NCBI中已发表的23个BBWV2 LCP基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列一致性分别为79.9%~95.2%和80.5%~97.2%。基于LCP基因核苷酸序列进行种群结构和遗传多样性分析,结果表明在系统发育进化树中,BBWV2可分为两大支。不同寄主BBWV2 LCP基因的遗传距离在0.049~0.332。

复合侵染的蚕豆黄花叶病病原诊断

应用透射电镜、ELISA和RT-PCR技术对浙江丽水的蚕豆黄化花叶病株进行了病原诊断,电镜负染色发现病株汁液中存在线状和球状两种病毒粒子,线状粒子长度在600nm^800nm的占73%,球状粒子直径约26nm;超薄切片观察到细胞质中存在Ⅱ型风轮状内含体及大量电子致密无定型体,还有线粒体增生聚集和膜结构的增生,两类细胞病变现象出现在相邻细胞中;用BBWV 2的单克隆抗体对病汁液ELISA检测结果为阳性反应;用Potyvirus通用引物进行RT-PCR检测有1.7kb特异性扩增片段产生。根据以上结果诊断病原为蚕豆萎焉病毒2(BBWV 2)和菜豆黄花叶病毒(BYMV),二者为复合侵染。

我国太子参主产区病毒病发生情况调查

为调查我国太子参主产区病毒病发生情况,使用RT-PCR法对采自福建省柘荣县,贵州省施秉县、丹寨县和安徽省宣城市的71份具有典型病毒病症状的太子参样品进行检测,并根据CP氨基酸序列对不同地区病毒进行系统进化分析。RT-PCR结果显示,65份样品检出病毒,检出率为91.55%,其中,56份样品检出芜菁花叶病毒Turnip mosaic virus(TuMV),49份样品检出蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2(BBWV2),9份样品检测出黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV),检出率分别为78.87%、69.01%和12.68%。未检测到烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus(TMV)。序列和系统发育进化分析显示,本研究获得的TuMV、BBWV2和CMV与NCBI数据库中的序列相似度较高,核苷酸相似度分别为98.05%~98.98%、93.61%~94.25%和98.02%~99.17%,氨基酸序列相似度分别为:96.14%~97.47%、97.33%~98.50%和98.00%~100%,分别属于World-B组、Ⅰ-a亚组和Ⅱ组。

地肤病毒病的病原分析

目的：分析地肤病毒病的病原。方法：在生物学检测的基础上，提取病毒双链RNA（dsRNA），合成单链cDNA后经多重PCR扩增、测定序列并分析，对地肤病毒病进行了鉴定。结果：有明显花叶症状的地肤由蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）侵染所致。将地肤分离物（Isolate-DF）中部分病毒序列进行比对分析，发现其与已报道的15个不同来源BBWV2序列的同源性为79.9%～88.0%。结论：通过分子鉴定，首次证实我国药用植物地肤上发生的花叶病毒病系由BBWV2侵染所致。

免疫胶体金标记定位昆诺藜中的胼胝质和胼胝质降解酶

运用免疫胶体金技术研究了感染蚕豆萎蔫病毒2号以及健康昆诺藜细胞中胼胝质和胼胝质降解酶的分布情况。电镜观察发现胶体金特异性标记在含有VP37小管的胞间运动通道周围,其余区域感病和健康细胞的胼胝质及胼胝质降解酶分布差别不大,胼胝质主要分布于细胞间隙的大块电子致密物质以及细胞壁结构发生较大变化的区域,胼胝质降解酶主要分布于筛板、维管束细胞紧贴细胞壁区域的大块电子致密物质上,在细胞壁结构发生较大改变的区域也有胼胝质降解酶的分布。推测胼胝质在昆诺藜细胞中的积累和降解可能与细胞壁结构成分改变有关。

太子参蚕豆萎蔫病毒2号CP基因的遗传多样性及分子进化分析

为了解太子参蚕豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)的遗传多样性及分子进化关系,本研究对5个不同地理来源的6份太子参病叶样品进行了BBWV2外壳蛋白(coat protein,CP)基因的RT-PCR扩增和克隆。序列分析结果表明,所得13条太子参BBWV2 CP基因序列均为1 345 bp,其核苷酸序列同一性在81.0%~99.0%之间,氨基酸序列同一性在93.5%~99.3%之间;核苷酸多样性为0.084 00;存在280个核苷酸多态性位点,其中232个为地域特异性位点;总变异数为278个,其中同义突变29个,异义突变249个。不同地理来源的太子参BBWV2分离物之间遗传分化程度较高,基因交流不频繁,遗传漂变可能导致分离物间明显的遗传分化。在系统进化树中,太子参分离物的聚类呈现出明显的地域特异性,江苏、贵州、湖南、福建分离物均聚类在I-a亚组,而山东分离物聚类在II-c亚组,遗传距离较远。研究表明,太子参BBW V2存在很高的遗传变异,基因突变是其产生遗传多样性的主要驱动力,而地理因素与其具有较高的核苷酸多样性密切相关。

侵染白术的蚕豆萎蔫病毒2号的分子检测与序列分析

为鉴定引起山西绛县白术花叶、黄化等症状的病原，利用生物学接种、非序列依赖性PCR扩增（SIA）和RT-PCR的研究方法，对白术病样进行了研究，结果表明：接种感病白术病汁液的指示植物昆诺藜表现退绿枯斑，经单斑分离后转接健康白术植株呈现出与病样类似的症状，初步证明白术病害可能为病毒引起的；SIA检测表明感病白术为蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）侵染所致；为明确BBWV2白术分离物（BBWV2-Am）的分类地位，进一步克隆了BBWV2-Am RNA2外壳蛋白大亚基基因（LCP）和外壳蛋白小亚基基因（SCP）序列；序列同源性分析表明，LCP基因和SCP基因与已发表的BBWV2其它株系相应基因核苷酸序列的同源性分别为79.3%～87.2%和80.1%～89.2%，氨基酸序列同源性分别为91.2%～95.7%和89.4%～95.5%；系统进化树分析显示，BBWV2-Am与BBWV2地黄分离物（BBWV2-Rg）形成一个独立分支，二者亲缘关系最近。这是BBWV2侵染白术的首次报道。

蚕豆萎蔫病毒2号分离物PV131和P158侵染寄主植物的细胞病理比较观察

透射电镜观察比较了蚕豆萎蔫病毒2号(BBWV-2)分离物PV131和P158侵染昆诺藜(Chenopodium quinoa)和蚕豆(Viciafaba)的细胞超微结构变化。结果显示:受PV131分离物侵染的昆诺藜叶肉细胞质中膜结构大量增生,形成有膜状结构、大小泡囊及电子致密物质的特殊膜增生区;病毒粒子散布在细胞质中,形成大块结晶体和管状结构,该管状结构直径约75nm,横切面由9个病毒粒子组成;受PV131侵染的蚕豆叶肉细胞中也形成膜增生区和管状结构,未见病毒结晶体。受P158分离物侵染的昆诺藜和蚕豆叶肉细胞病变情况与PV131分离物相似,形成膜增生区和相同的管状结构,在蚕豆叶肉细胞中也未观察到病毒结晶体。上述结果表明:2个BBWV-2分离物虽然在不同寄主植物上引起的细胞病变程度有差异,但其细胞病理学特征是由病毒基因结构所决定,与寄主的种类无关。