松针褐斑病菌的产毒培养和毒素粗提方法

松针褐斑病菌在PD和MS培养基中生长良好 ,能产生毒素。在这两种培养基中加入敏感寄主火炬松的针叶浸汁对毒素的产生和活性没有明显影响。甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿甲醇 (氯仿∶甲醇 =2∶3)混合溶剂等均能把毒素物质充分提取出来 ,苯、氯仿、乙酸乙酯等极性小的溶剂不能充分提取毒素。通过生测和高效液相 (HPLC)比较分析表明 ,采用MS培养液培养病菌 ,以氯仿甲醇混合溶剂提取毒素 ,将有利于毒素的产生和毒素的分离。

湿地松抗褐斑病无性系种子园营建技术研究

松针褐斑病(Lecanosticta acicola)是湿地松(Pinus elliottii)、火炬松(P.taeda)和黑松(P.tunbergii)的重要病害,防治比较困难。从1982年开始采用对比法在重病林分中选择湿地松抗病优树122株,嫁接繁殖建立抗病湿地松采穗圃2.7ha,并用自然感染法和人工接种法对繁殖成的122个优树无性系进行抗病性测定和筛选,其中约有1/2的无性系表现具极高的抗病性。利用筛选出的抗病无性系建成湿地松无性系抗病种子园4ha。

松针褐斑病菌毒素对寄主细胞质膜伤害机理的研究

用毒素粗提液处理寄主愈伤组织 2d后 ,可于光学显微镜下观察到严重的细胞原生质泡囊化现象 ,这是寄主受到毒素作用后于细胞水平所表现出的伤害症状。经毒素诱导后用ESR仪检测 ,寄主愈伤组织于 2h内即可产生比对照高得多的超氧阴离子自由基 ,继而诱发膜脂脂过氧化反应 ;随着毒素作用时间的延长 ,寄主细胞膜脂脂肪酸组成发生变化 ,总的变化趋势为不饱和脂肪酸含量减少 ,饱和脂肪酸含量增加 ;毒素作用后于 4h以内即可产生大量的MDA ,6h内则可检测到严重的离子渗漏 ,造成膜的破坏 。

松针褐斑病菌毒素活性的生物检测

松针褐斑病菌毒素不仅能伤害湿地松、火炬松等寄主植物的幼苗、针叶、根及愈伤组织 ,对非寄主植物水花生、紫茎泽兰的叶片也有伤害作用。在试验的几种生测材料中 ,湿地松愈伤组织对毒素伤害最敏感 ,湿地松幼苗、幼针叶 ,火炬松幼针叶和紫茎泽兰叶片次之 ,湿地松幼根、老针叶 ,火炬松老针叶 ,水花生和小麦叶片最不敏感。根据生测材料的敏感程度及表现症状的特异性分析可知 ,用湿地松、火炬松幼苗和幼针叶作生测材料较好。比较针刺法、浸渍法和涂抹法等几种生测方法表明 ,用针刺法接种毒素效果最好 ,其反应速度快 ,用量少 ,症状明显。因此建议在松针褐斑病菌毒素的生物检测中 ,以湿地松或火炬松幼苗或幼针叶作为材料 。

松针褐斑病菌毒素的确定及其基本性质研究

以ＭＳ液体培养基培养２０ｄ左右至菌丝大量生长并紧密交织成团时病菌即可大量产生毒素，病菌是否产孢对产毒量大小无显著影响。毒素原液中仅非蛋白质部分具致病活性，经高温高压灭菌１５ｍｉｎ后活性仍不丧失，且有所加强。该毒素在冷冻条件或灭菌后于室温下可保存两个月以上而不失活。毒素粗提液中活性成分为一类极性较大的物质，易溶于水、甲醇、乙醇，可溶于正丁醇，微溶于乙酸乙酯，不溶于苯，可被活性炭吸附并为甲醇所洗脱。毒素粗提液的ｐＨ值为６０，渗透势为－１２２ｋＰａ，经试验确定毒素粗提液的毒性非溶液的酸度或渗透势所致，从而进一步确定了病菌人工培养滤液中存在具致病活性的毒素物质。

磷酸葡萄糖脱氢酶和苯丙氨酸解氨酶与抗松针褐斑病的关系

松针褐斑病（Ｌｅｃａｎｏｓｔｉｃｔａａｃｉｃｏｌａ）是我国南方重要病害。在湿地松（Ｐｉｎｕｓｅｌｌｉｏｔｔｉｉ）抗褐斑病选育研究的基础上对湿地松针叶中的６－磷酸葡萄糖脱氢酶和苯丙氨酸解氨酶与抗病性的关系进行了研究分析。结果表明二年生健康针叶的６－磷酸葡萄糖脱氢酶的活性水平与针叶的抗病性有密切关系。在测定的１３个无性系和单株中，４个易感株的酶活性较低，９个抗病无性系中除个别酶活性与易感株相近外，其余无性系的酶活性和比活性都明显比易感株高。苯丙氨酸解氨酶的株间差异相对较小，但在总体水平上，抗病无性系的酶活性和比活性也比易感株略高。用松针褐斑病菌毒素液处理后，无论是抗病针叶还是易感针叶，６－磷酸葡萄糖脱氢酶的活性均呈上升趋势，升幅为０．５—１倍，但苯丙氨酸解氨酶的活性在用毒素处理后无明显变化。

松针褐斑病菌毒素的专化性研究

用松针褐斑病菌毒素粗提液处理湿地松、火炬松、黑松和马尾松的切根苗，发现湿地松和火炬松对毒素最为敏感，其次为马尾松，黑松最不敏感。毒素生测的结果与松树在田间自然感染的情况有一定的相似性，但不完全一致。不同湿地松抗病无性系对毒素的反应存在着差别，其中３３ 号所受伤害较轻，１０ 号及３６ 号较重。结合毒素薄层层析半定量试验，利用寄主愈伤组织对毒素的反应，发现毒素对寄主愈伤组织的最低作用浓度应在１００ μｇ／ｍ Ｌ 以下。试验了５ 种杂草对毒素的反应，其中空心莲子草和稞草对毒素敏感。进一步研究利用毒素作为除草剂不失为毒素利用的一个新思路。上述研究表明该毒素为非寄主专化性毒素。

湿地松针叶中的松脂含量及其单萜、倍半萜的组成与抗褐斑病的关系

研究分析了湿地松20个抗病无性系和14个易感株针叶中的松脂含量,结果表明抗病湿地松针叶中的松脂含量为7.17％,明显比易感株含量5.46％高。顶冠针叶的松脂含量与侧枝针叶的含量基本相近。对9个抗病无性系和4个易感株针叶挥发油中的单萜和倍半萜研究表明,湿地松针叶中的单萜和倍半萜的种类较多,不同无性系(或单株)间高含量单萜和倍半萜种类较稳定,某些低含单萜组分与抗病性之间存在着一定的联系。抗病无性系针叶中都缺乏在感病针叶中普遍存在的异龙脑和香草醇。

松针褐斑病菌毒素处理后湿地松组培苗PAL、PPO、SOD活性变化研究

为研究抗松针褐斑病菌在湿地松子代组培苗体内的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化与其抗病性的关系,以抗病湿地松瓶内组培苗和温室1年生组培苗针叶为材料,测定PAL、PPO、SOD的活性。结果表明:松针褐斑病菌毒素处理后,湿地松PAL和PPO活性与抗病性成一定正相关关系,SOD活性与植株抗病性在48 168 h内表现有一定的负相关性。

内吸杀菌剂根系打浆防治松针褐斑病

湿地松或火炬松1年生苗,用一定浓度多菌灵或甲基托布津泥浆根系打浆处理,然后定植于苗圃中。30～50天后接种松针褐斑病菌(Lecanosticta acicola),又经50天左右检查感病情况;或将处理苗定植于发病林地上,任其自然发病,每年检查感病情况,共2～3年。所有杀菌剂处理浓度,在短期或1年内均可显著降低松针褐斑病的侵染,当年松苗感病程度与杀菌剂处理浓度没有明显相关性。但第2年或第3年,松苗感病程度随时间而增加,且与杀菌剂处理浓度呈明显负相关。结果表明,松苗定植前用含有效成分3％～5％多菌灵或含有效成分5％～10％甲基托布津泥浆处理根部,可在2～3年内有效地防止松针褐斑病的侵染。

抗松针褐斑病湿地松体内氧化酶的变化

松针褐斑病（Ｌｅｃａｎｏｓｔｉｃｔａａｃｉｃｏｌａ）是湿地松（Ｐｉｎｕｓｅｌｌｉｏｔｔｉｉ）上的重要病害。分析湿地松的９个抗病无性系和４个易感株２年生针叶中过氧化物酶和多酚氧化酶的活性。结果表明湿地松针叶中过氧化物酶活性很高，多酚氧化酶活性相对较弱．而且抗病植株的过氧化物酶和多酚氧化酶活性都明显高于感病植株。过氧化物酶活性与多酚氧化酶活性之间里明显正相关，相关系数０．９。湿地松的１年生针叶中多酚氧化酶和过氧化物酶活性都非常低，而且在抗病与感病针叶间酶活性无明显差别。用病原菌毒素初提液处理针对可使抗病和感病植株的过氧化物酶活性都明显提高，而且易感株的上升幅度比抗病株高。相反。多酚氧化酶活性在用毒素处理后都表现下降，而且抗病株的降幅比易是株大。

湿地松对松针褐斑病的抗性测定

从松针褐斑病（Ｌｅｃａｎｏｓｔｉｃｔａａｃｉｃｏｌａ）重病林分中选出３６个湿地松（Ｐｉｎｕｓｅｌｌｉｏｔｔｉｉ）抗病表现型优树无性系，用人工喷洒病菌孢子液接种法对其进行抗病测定，结果表明，有２２个是高度抗病的。与用松针褐斑病产生的毒素粗提液处理上述无性系的离体针叶进行抗病性测定的结果基本一致，相关系数为０．８０。

松针褐斑病菌毒素对紫茎泽兰伤害的初步研究

研究了松针褐斑病菌毒素对紫茎泽兰不同部位的伤害以及不同毒素粗提液浓度对叶片的伤害效果,进行了叶片愈伤组织的培养,在此基础上探讨了毒素对紫茎泽兰叶片和愈伤组织过氧化氢酶的影响.结果表明:紫茎泽兰叶片对该毒素最敏感,根对毒素只有轻微的反应;毒素粗提液稀释2倍,仍然对紫茎泽兰叶片有明显的伤害作用;以MS+6 mL(1 mg/mL)2,4-D培养紫茎泽兰叶片分化良好,愈伤组织生长速度快;毒素处理后叶片和愈伤组织CAT活性在6 h达到最高,呈现先升后降的趋势.

抗松针褐斑病湿地松组培再生植株抗病性测定

采用松针褐斑病菌毒素处理湿地松瓶内组培苗和温室组培苗针叶、采用苗圃组培苗人工接种松针褐斑病菌孢子悬浮液测定抗病性。结果表明:湿地松不同家系间抗病性差异显著、同一家系不同无性系间抗病性差异也显著。湿地松瓶内组培苗各无性系抗病性强弱依次为8#40,8#2,8#11,32#3,普通组培苗;温室组培苗各无性系抗性强弱依次为32#7,32#3,普通组培苗。苗圃组培苗与实生苗间、组培苗不同代数间抗病性差异显著。单元回归分析表明,瓶内测定结果与温室针叶测定结果的相关系数r^2=0.999 7、与苗圃接种孢子悬浮液测定结果的相关系数r^2=0.958 8。因此,为了缩短选育时间,减少成本,一定程度上可以用瓶内抗病性测定替代室外抗病性测定。

松针水抽提物及其酸度与抗褐斑病的关系

本研究表明，松针褐斑病菌（Ｌｅｃａｎｏｓｔｉｃｔａａｃｉｃｏｌａ）在抗性不同的松针水抽提液中的生长情况明显不同。病菌分生孢子在抗病的湿地松（Ｐｉｎｕｓｅｌｌｉｏｔｉｉ）、马尾松（Ｐ．ｍａｓｓｏｎｉａｎａ）以及易感的湿地松和黑松（Ｐ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）的松针水抽滤液中的萌发率分别为３８．７％、４６．１％、５１．９％和５５．２％。菌丝在抗病的松针抽滤液中生长也远不及在易感松针的抽滤液中好。抗病和易感湿地松针叶的ｐＨ值和缓冲容量几乎完全相同，马尾松和黑松的松针抽滤液的ｐＨ比湿地松略高些，但缓冲容量比抗病和易感湿地松都小，显然，湿地松对松针褐斑病的抗性与松针中的某些水抽提物质存在一定联系，但与其ｐＨ值和缓冲容量无关。

抗松针褐斑病湿地松未成熟合子胚胚性愈伤组织的诱导

【目的】建立高效实用的抗松针褐斑病湿地松优良无性系的离体快繁体系,为湿地松优良种苗的商业化应用提供技术基础。【方法】以福建官庄林场采集的抗松针褐斑病家系湿地松未成熟合子胚为外植体,分析影响湿地松胚性愈伤组织诱导的主要因素:对外植体材料的预处理进行研究,利用单因素实验筛选适合湿地松未成熟球果的采集及冷藏时间;对培养基中影响胚性愈伤组织诱导的主要添加物中的碳源(麦芽糖、蔗糖和葡萄糖)、肌醇和抗坏血酸进行单因素实验,对α-酮戊二酸和丙酮酸进行双因素实验分析;最后对影响胚性愈伤组织诱导的主要激素,如生长素(2,4-二氯苯氧乙酸)和细胞分裂素(6-苄基氨基嘌呤和激动素)进行随机组合分析。【结果】(1)未成熟湿地松球果体胚最佳诱导时间为6月底至7月中上旬;(2)1000 mg/L肌醇和30 g/L麦芽糖最适宜湿地松胚性愈伤组织的诱导;(3)抗坏血酸质量浓度为0、1、2、3 mg/L时,对湿地松胚性愈伤组织诱导的影响区别不大;但同时添加α-酮戊二酸和丙酮酸时明显促进了湿地松愈伤组织的诱导;(4)湿地松最佳诱导培养基与激素组合为基本培养基LP+2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+2 mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-BA)+2.5 mg/L激动素(KT)。【结论】通过对湿地松球果的预处理,获得了适合湿地松愈伤组织诱导的材料,并且确定了适合胚性愈伤组织诱导的合子胚发育阶段,即2~4阶段,以及合适的采集期。另外,对诱导培养基中主要添加物和激素进行研究,筛选出了1种较优的湿地松愈伤组织诱导的培养基,确定了适合湿地松胚性愈伤组织诱导的主要条件,可为提高湿地松胚性愈伤组织诱导率、促进湿地松体胚发生提供参考。