布鲁氏菌外膜蛋白免疫蛋白质组学方法的建立

目的建立布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,筛选布鲁氏菌保护性抗原。方法利用双向电泳技术对实验条件下培养的布鲁氏菌疫苗株M5外膜蛋白进行分离,结合WB(Western blotting)技术寻找发生免疫反应的蛋白质。结果21个免疫蛋白点经胶内酶切、肽提取后用基质辅助激光解析/电子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。每个蛋白点的肽质量指纹图谱用Mascot进行检索后,代表了12个开放阅读框。这些蛋白不全是外膜蛋白,还存在胞浆蛋白,其功能涉及生物合成和物质代谢等领域,还有一个功能未知的蛋白。结论成功建立了布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,为寻找保护性抗原及为新型疫苗抗原候选提供新思路。

布鲁氏菌胞内生存机制研究进展

布鲁氏菌是一种胞内寄生菌,可以在专业和非专业吞噬细胞内生存和复制。当布鲁氏菌与细胞接触时,细菌可以通过受体分子进入细胞。布鲁氏菌在细胞内首先定位于早期吞噬体,然后,在胞内改变其运输方向,最终抵达其胞内复制部位内质网,开始大量复制。这种复制既不影响细胞的基本功能,也不诱导细胞的损伤。主要综述了布鲁氏菌对细胞的侵袭、胞内运输和复制的相关研究进展。

布鲁氏菌多重聚合酶链反应鉴定研究

目的在同一体系中对布鲁氏菌6个种进行鉴定。方法根据布鲁氏菌6个种的差异基因设计5对引物,应用多重聚合酶链反应(PCR)方法对布鲁氏菌进行鉴定。先用标准菌株建立方法,优化实验条件,然后扩增地方株进行验证。结果除绵羊附睾种外多重引物PCR方法能将其余5个布鲁氏菌种全部鉴定出来。结论这种方法快速准确,且对实验操作人员安全,是布鲁氏菌鉴定的辅助方法。

三种布鲁氏菌病疫苗株的毒力比较

为系统比较我国现有布鲁氏菌病疫苗株A19、M5和S2的毒力,分别用上述3种疫苗株以1×105CFU/只免疫Balb/c小鼠,免疫后每隔2周采集小鼠脾脏,分离细菌,测定各疫苗株在小鼠脾脏中的存留时间。结果 A19、M5、S2在小鼠体内存活时间依次为14周、大于16周、6周。将以上3种疫苗株分别以1×109CFU/只免疫Hartley豚鼠,15日后测定豚鼠脾脏含菌量,结果 A19、M5、S2免疫后每克脾脏含菌量分别为2.8×104CFU、大于6.7×105CFU、3.8×103CFU。研究结果表明,我国目前使用的布鲁氏菌疫苗中,S2毒力最弱,A19其次,M5最强。

布鲁氏菌猪种标准株外膜蛋白OMP25的原核表达

目的克隆布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因并构建基因的原核表达系统。方法用聚合酶链反应技术扩增得到布鲁氏菌基因组,得Omp25基因片段,T-A克隆后测定核苷酸序列,将目的基因定向插入原核表达载体pGEX-4T-1,经双酶切和DNA测序测定,将构建的重组质粒转化大肠杆菌(E.coliHB101,TOP10),经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白rOmp25表达情况。结果经DNA测序显示Omp25DNA序列和插入位点正确,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-Omp25,经IPTG诱导,特异性表达出以包涵体形式存在48kDa的Omp25融合蛋白。结论制备、克隆了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因片段,并在大肠杆菌中表达出Omp25融合蛋白。

布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的表达纯化及生物活性鉴定

目的:原核表达系统表达布鲁菌核糖体蛋白L7/L12与GST的融合蛋白GST-L7/L12,并纯化蛋白L7/L12,建立检测特异性抗体的间接ELISA方法。方法:对含有L7/L12的原核表达载体pGEX-4T-1-L7/L12进行了原核表达。利用亲和层析柱分别纯化融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12,并用SDS-PAGE及Western印迹分析鉴定。以L7/L12为抗原包被微量板,优化抗原包被浓度和羊抗鼠IgG-HRP稀释度,建立间接ELISA方法,并检测其特异性。结果:SDS-PAGE结果显示在相对分子质量为38000和12000处可见纯化蛋白的条带,Western印迹分析表明这2条带均能被免疫兔血清识别,表明获得了纯化的有生物活性的融合蛋白GST-L7/L12和蛋白L7/L12。间接ELISA方法的L7/L12抗原包被浓度为5μg/mL,羊抗鼠酶标二抗稀释度为1∶1000。小鼠免疫血清与L7/L12抗原出现阳性反应,而与布鲁菌融合蛋白OMP31、结核分枝杆菌抗原85b及牛血清白蛋白则呈阴性。结论:成功地对布鲁菌核糖体蛋白L7/L12进行了原核表达和纯化,以其为基础建立的间接ELISA方法稳定且特异。

利用重组外膜蛋白OMP31检测牛布氏杆菌血清抗体OMP31-ELISA方法的建立

为了研究牛布氏杆菌血清抗体快速诊断方法,试验采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31基因,将该基因插入原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌DE3进行诱导表达,再将表达产物重组外膜蛋白OMP31纯化后作为抗原,建立检测牛布氏杆菌血清抗体的OMP31-ELISA,并对最适反应条件进行确定,然后对从河北省部分牛场采集的150份腹泻奶牛血样进行血清抗体检测。结果表明:牛布氏杆菌OMP31蛋白成功表达,表达产物能与牛布氏杆菌免疫兔血清反应;建立的OMP31-ELISA最佳工作条件为外膜蛋白OMP31抗原的最适包被浓度2.0μg/mL,酶标抗体的工作浓度1∶400,血清稀释度1∶160,以3%明胶-PBS封闭30 min。检测的150份临床血清样本中,特异性、敏感性和符合率分别为90.91%(50/55)、95.79%(91/95)、94.00%(141/150)。说明本方法特异性强、敏感性高,快速,使用方便。

应用套式PCR快速检测奶牛中布鲁氏菌的研究

研究根据GenBank公布的牛布鲁氏菌基因序列设计内、外向引物,优化牛奶样品中布鲁氏菌基因组DNA提取方法,建立了牛奶布鲁氏菌套式PCR方法。试验建立的布鲁氏菌套式PCR检测方法,具有高度的特异性和敏感性,适用于布鲁氏菌的实验室快速检测。

羊种布鲁氏杆菌16M对PI3K/Akt信号通路的激活

为了检测巨噬细胞内羊种布鲁氏杆菌16M（16M）对PI3K/Akt信号通路的激活,试验将16M侵染巨噬细胞应用Western-blot技术检测巨噬细胞内p-Akt（S473）和p-Akt（T308）表达变化,利用抑制剂LY294002对PI3K/Akt信号通路进行阻断,用MTT法检测抑制剂LY294002对细胞活性的影响。结果表明：16M在0.5-4 h可激活PI3K/Akt信号通路;抑制剂LY294002可阻断16M对PI3K/Akt信号通路的激活,且具有浓度依赖性;抑制剂LY294002在小于或等于20μmol/L浓度时不影响细胞活性。

猪型布鲁氏菌rBLS重组蛋白的纯化与抗体制备

以猪型布鲁氏菌的BLS分子作为研究对象,通过重组蛋白质的纯化以及多克隆抗体的制备,研究了重组rBLS分子的免疫原性。结果表明:布鲁氏菌BLS分子具有较好的抗原性质,可以刺激家兔产生相应的抗体。

抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体制备及初步鉴定

制备抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12的单克隆抗体(mAb),为进一步研制布鲁菌检测方法和免疫制剂提供基础。常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗核糖体蛋白L7/L12的mAb,并用Westernblot和ELISA方法对其特异性、抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。获得了4株抗L7/L12蛋白的mAb:1B1,2A2,2H9和2H10,相对亲和力为2A2>2H10>2H9>1B1,4株mAb识别的抗原表位相近,但仍存在一定的差异。得到的4株稳定的杂交瘤细胞系分泌的mAb能特异结合L7/L12蛋白。

LAMP技术快速诊断布鲁氏菌病的研究

旨在应用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)对布鲁氏菌进行研究。针对布鲁氏菌保守基因16S r DNA设计LAMP引物,通过浊度法对LAMP反应条件进行优化,应用建立好的LAMP反应条件进行特异性及灵敏性试验。结果显示:(1)优化后的反应条件是62℃恒温60 min,内引物1.50μmol/μL、外引物0.20μmol/μL、环引物1.0μmol/μL。(2)该LAMP方法与3株布鲁氏菌均发生了扩增反应,达到阳性浊度值,而与小肠耶尔森(ATCC9510)、大肠杆菌(ATCC25922)、沙门氏菌(ATCC10708)和金黄色葡萄球菌(ACTT33591)等标准菌株没有扩增反应。(3)浊度法和实时荧光法两种方法的检测最低限分别为4.36 fg/μL和436 fg/μL,其灵敏度均高于普通PCR的最低检出值4.36 pg/μL。LAMP检测技术用于布病临床诊断具有快速、高效、便捷等特点,对于基层布病的病原学诊断具有实用价值。

宁夏盐池县人体感染布鲁氏菌种型调查的研究

目的调查宁夏盐池县布鲁氏菌病就诊人群感染布鲁氏菌种型。方法对就诊人群进行血清学检测,并采用双相血培养瓶从SAT检测≥1∶400的现症病人血液中分离培养布鲁氏菌,传统细菌学方法和分子生物学检测方法鉴定布鲁氏菌。结果从调查的70例病人血液样本中分离到布鲁氏菌12株,BCSP31基因经PCR检测扩增得到223 bp,AMOS-PCR检测均扩增到731 bp和178 bp,结合传统鉴定方法中的染料抑菌、噬菌体裂解和单向特异性血清凝集试验鉴定12株菌均为羊种3型布鲁氏菌。结论宁夏盐池县人体感染布鲁氏菌为羊种3型,与盐池县毗邻省份内蒙菌株种型一致,同时也与宁夏近年来流行主要布鲁氏菌种型一致。

猪种布鲁氏菌对4种常用新型消毒剂敏感性的研究

为了确定常用新型消毒剂对布鲁氏菌的杀菌/抑菌效果,本研究将聚维酮碘、戊二醛、戊二醛癸甲溴铵复方溶液、二氯异氰尿酸钠4种常用消毒剂与定量B.suis混合均匀,分别作用3 min、10 min与30 min,取0.1 m L涂布于TSA培养基中进行菌落计数;通过对不同消毒剂、不同作用时间其杀菌率的对比,确定不同消毒剂对B.suis的敏感程度。研究表明,B.suis对聚维酮碘溶液敏感性最强,10%聚维酮碘溶液1 000倍稀释作用3 min便能有效杀灭B.suis;其次戊二醛与癸甲溴铵混合溶液效果显著优于戊二醛单独使用,100倍稀释后可有效杀灭B.suis,1 000倍稀释后作用30 min可100%杀灭B.suis;而单独使用戊二醛,仅在10倍稀释时3~30 min能有效杀灭该菌,100倍稀释时作用30 min,其杀菌率仅达93%;而二氯异氰尿酸钠在4种消毒剂中消毒效果最不理想,其最高杀菌率仅为67%;因此,在布鲁氏菌病的防控中,消毒剂以聚维酮碘与戊二醛癸甲溴铵复方制剂为最佳选择。

布鲁氏菌病患者菌型鉴定及T淋巴细胞亚群和IL-6与IFN-γ的诊断价值

目的探究布鲁氏菌病患者菌型鉴定及T淋巴细胞亚群和白细胞介素-6(IL-6)与干扰素-γ(IFN-γ)及其诊断价值.方法选择2018年3月-2021年6月中国医科大学附属第一医院收治的106例布鲁氏菌病患者为研究对象,对布鲁氏菌给予生物学及菌种鉴定.根据病程将其分为急性组与慢性组,比较两组T淋巴细胞亚群及IL-6、IFN-γ水平,分析其与布鲁氏菌病慢性化的关系及其诊断价值;对急性组患者均给予针对性治疗,根据治疗后临床疗效将其分为有效组及无效组,分析外周血T淋巴细胞亚群及IL-6、IFN-γ及对临床疗效的诊断价值.结果经多重聚合酶链式反应(PCR)检验分析得,106株临床分离的布鲁氏菌株中检出布鲁氏菌羊种生物3型菌株86株、羊种生物2型菌株17株、猪种生物1型菌株3株;急性组CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)比例高于慢性组,CD_(8)^(+)比例及IL-6、IFN-γ低于慢性组(P<0.05);T淋巴细胞亚群及IL-6、IFN-γ联合检测诊断布鲁氏菌病慢性化的曲线下面积(AUC)大于各指标单独检测(P<0.05);有效组治疗后CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)高于无效组,CD_(8)^(+)比例及IL-6、IFN-γ低于无效组(P<0.05);急性期患者治疗后T淋巴细胞亚群及IL-6、IFN-γ水平联合检测评估临床疗效的AUC大于各指标单独检测(P<0.05).结论布鲁氏菌羊种生物3型为布鲁氏菌病感染的主要菌型,患者外周血指标联合检测对疾病慢性化及急性期患者治疗疗效具有评估价值,且其T淋巴细胞亚群比例及IL-6水平异常或与疾病进展和疗效相关.

多位点可变数目串联重复序列分型方法检测布鲁氏菌分型标准化操作方法的建立和应用

目的建立常用布鲁氏菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的标准化方法及应用研究。方法选取16个位点,通过核酸提取、聚合酶链反应(PCR)、琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳等技术,结合BioNumerics(Version 5.0)软件,对16株布鲁氏菌标准菌株和不同地区分离的32株菌株进行分型。结果利用所建立的MLVA方法可以区分16株布鲁氏菌标准菌株,并可以将32株地方株区分为牛种和羊种两大类。结论初步建立了MLVA标准化方法,可以在种的水平鉴定布鲁氏菌,还可以追溯传染源,确定流行趋势。

湖北省随州市2016年3例布鲁氏菌病流行病学调查及菌株鉴定

目的对湖北省随州市就诊的3例疑似布鲁氏菌病(布病)患者进行个案调查,并对分离的3株疑似布鲁氏菌鉴定分型。方法应用布病流行病学调查表进行现场调查,采用布鲁氏菌常规鉴定分型方法和噬菌体裂解试验进行检测,并比较BCSP31-PCR法(以布鲁氏菌属特异基因BCSP31为靶基因的检测方法)、AMOS-PCR(根据电泳条带鉴别布鲁氏菌牛种1、2、4型、羊种布鲁氏菌、猪种l型、绵羊附睾种)及实时荧光定量PCR 3种分子分型种型鉴定方法。结果 3例患者均由密切接触病畜及其肉制品感染,常规检测方法鉴定为羊种布鲁氏菌3型,多种PCR方法检测获得同样结果。结论经常规和PCR鉴定分型研究确定,随州市布病病例分离株为羊种布鲁氏菌3型。

布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9免疫原性检测

目的检测布鲁杆菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9的免疫原性，寻找潜在的、新的布鲁杆菌亚单位疫苗靶标。方法采用双酶切的方法，将布鲁埃希菌VirB9基因全长克隆至原核表达载体pET32a上，将克隆后载有VirB9基因的pET32a质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，异丙基-13-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导重组VirB9蛋白在大肠埃希菌中的表达。利用重组VirB9蛋白所携带的His标签，通过Ni—NAT层析，纯化在大肠杆菌中重组表达的VirB9蛋白．再通过十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）电泳和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒对纯化的蛋白进行纯度及浓度检测。用布鲁杆菌疫苗株S19株免疫BALB／c小鼠，并以磷酸盐缓冲液（PBS）为对照。在免疫4周后，鼠尾取血，血清虎红平板凝集试验、试管凝集试验检查小鼠血清抗体；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测$19株免疫小鼠体内抗VirB9抗体滴度。在免疫后第35天，取小鼠脾脏，分离脾细胞，利用Elispot技术，检测VirB9蛋白体外再刺激后分泌细胞因子（干扰素-1，IFN-1）的脾细胞数，酶联斑点图像仪计数斑点，每个斑点代表1个抗原特异性T淋巴细胞，分析VirB9刺激机体产生细胞免疫反应的情况。结果通过酶切克隆的方法成功地将VirB9全长基因741bp克隆至pET32a载体上。SDS—PAGE显示，VirB9蛋白的相对分子质量约43×103，纯度超过97％；BCA法检测，蛋白浓度为1．6异／L。免疫组小鼠血清虎红平板凝集试验阳性，试管凝集试验小鼠血清抗体滴度〉1：800；对照组小鼠血清虎红平板凝集试验阴性，试管凝集试验小鼠血清抗体滴度阴性。免疫组检测到抗VirB9蛋白抗体，抗体滴度均〉1：3200，对照组小鼠体内未检测到抗VirB9蛋白抗体的存在。酶联斑点图像分析显示，用VirB9蛋白体外刺激，免疫组小鼠5×10s个脾细胞中有147个细胞可以分泌IFN-r，对照组仅有38个细胞。结论在布鲁杆菌感染过程中，Ⅳ型分泌系统蛋白VirB9具有免疫原性．能够刺激小鼠产生体液免疫反应与细胞免疫反应。

2014年四川省实验室检测布鲁氏菌病例分析

目的 掌握2014年四川省人间布鲁氏菌感染情况,为四川省布鲁氏菌病（布病）防控提供依据。方法 对2014年四川省疾病预防控制中心门诊部就诊的疑似布病患者进行流行病学调查,用试管凝集试验检测布鲁氏菌抗体。结果 共检测305例,血清学检测阳性32例;不同性别检测血清阳性率差异有统计学意义;发病年龄主要集中在41~60岁之间,占总阳性人数的78.13%;病例分布于8个地市,以眉山市占总阳性人数比例最高为25.00%;职业分布以养殖羊和牛人数比例最高为34.38%;主要临床症状为发热、多汗、乏力,分别占90.63%、62.50%和68.75%;肌肉、关节酸痛者占59.38%;感染源主要为羊、牛及其制品,感染途径为直接接触及消化道传播。结论 四川省多地存在布鲁氏菌感染病例,疫情漏报严重,疫情呈明显回升趋势,需在全省加强布病的防控工作。

山西省人源羊种布鲁氏菌的MLVA-2B及rpoB基因分型研究

目的采用多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA-2B）方法及rpoB基因分型方法对山西省分离的布鲁氏菌进行基因型分析。方法2014—2015年在山西省布鲁菌病（简称布病）监测点采集已确诊的布病患者血液进行血培养，对培养出的布鲁氏菌进行传统的生物分型鉴定。选取MLVA panel 2的8个位点进行分型，并对分型结果进行聚类分析。同时采用PCR方法对分离菌株rpoB基因4个相关突变位点进行扩增，PCR产物测序结果与标准菌16M进行比对。结果采用MLVA panel 2B分型方法对41株羊3型布氏菌进行聚类分析，所有菌株可分为5个群，31个基因型，基因型相似度在64.78%～100%。rpoB基因检测发现39株为rpoB-2型（629-GTG/985-GTC/1309-CTA，95.12%），2株为rpoB-2 variant型（629-GTG/1309-CTA，4.88%）。结论MLVA基因分型对追溯传染源，分析布病的流行和暴发有重要意义。MLVA panel 2B位点变异度更高，提示用panel 2B的5个位点对分析研究同一生物型菌株的变异情况更简便和高效。应用rpoB基因多态性分析发现，我省的菌株有39株为rpoB-2型，还有2株为新发现的rpoB-2突变型。同时发现了rpoB基因分型与MLVA分型方法可能存在相关性。