布鲁氏菌分泌蛋白BspJ多克隆抗体的制备

为获得一定纯度及浓度的布鲁氏菌分泌蛋白BspJ并制备多克隆抗体,本研究通过常规PCR方法扩增BspJ基因,连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆;使用限制性内切酶切下目的片段后连接至pET28a(+)载体,双酶切、菌液PCR验证阳性克隆菌并送测序;表达载体pET28a-BspJ转入大肠杆菌DE3后经IPTG诱导表达,收集表达菌进行SDS-PAGE分析;使用His标签蛋白纯化柱纯化目的蛋白rBspJ;将rBspJ蛋白混入弗氏佐剂分4次免疫实验兔,收集兔血清,Western blot鉴定多克隆抗体,饱和硫酸铵法纯化多克隆抗体.结果显示:PCR方法扩增出大小534 bp的目的片段,测序结果正确,表明成功构建出pMD19-T-BspJ克隆载体及pET28a-BspJ表达载体;表达菌表达出大小约24 kDa的rBspJ,纯化后的rBspJ条带明显,基本无杂带,表明成功纯化出rBspJ;真核表达的rBspJ与制备的多克隆抗体反应,表明成功制备多克隆抗体.本研究结果为BspJ蛋白的亚细胞定位分析、功能研究及布鲁氏菌致病机制的研究积累实验数据和奠定基础.

布鲁氏菌分泌蛋白BspJ亚细胞定位分析

[目的]对布鲁氏菌分泌蛋白BspJ进行亚细胞定位分析,为深入探索该分泌蛋白的功能奠定基础。[方法]使用生物信息学方法对分泌蛋白BspJ的核酸和氨基酸序列进行生物信息学分析;利用常规PCR方法扩增BspJ目的基因并克隆到pMD19-T载体;构建真核表达载体pDsRed2-C1-BspJ并转染HEK293T细胞,制作细胞爬片后进行激光共聚焦显微镜分析;利用RT-PCR方法分析HEK293T转染细胞中BspJ转录情况。[结果]生物信息学分析结果显示,BspJ基因ORF全长是531bp,共编码177个氨基酸,BspJ蛋白无跨膜结构,有7个抗原决定簇,具有核定位信号(NLS)和核输出信号(NES),据此推测BspJ蛋白亚细胞定位可能具有核—胞浆穿梭过程;PCR方法扩增出BspJ基因;成功构建pDsRed2-C1-BspJ重组质粒;激光共聚焦分析显示BspJ蛋白定位于宿主细胞核及核周围;RT-PCR分析显示BspJ基因于宿主细胞中进行转录。[结论]布鲁氏菌分泌蛋白BspJ分布于宿主细胞核及核周围,可能具有胞核—胞质穿梭过程。