大螟中肠氨肽酶N基因的克隆及表达谱分析

昆虫中肠氨肽酶N是Bt毒素的重要受体之一,与Bt毒素的杀虫机制及昆虫Bt抗性的产生密切相关。本研究通过简并引物PCR结合RACE技术克隆并获得大螟Sesamia inferensBt受体蛋白——氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)基因的cDNA序列全长,经NCBI同源比对分析,认为该基因为APN3基因,并将其命名为SiAPN3(GenBank登录号为HQ636624)。序列分析表明,该基因的cDNA序列全长为3411bp,开放阅读框为3018bp,编码1006个氨基酸;预测蛋白质分子量为114kD,等电点为4.95;其推导的氨基酸序列中具有鳞翅目昆虫氨肽酶N典型的结构特征,即含有1个N-和12个O-连接的糖基化位点,N-末端具有18个氨基酸的剪切信号肽,谷氨酸锌化氨肽酶保守结构GAMEN,锌结合位点HEXXHX18E,C-末端具有22个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号肽。采用实时定量PCR研究了SiAPN3在大螟4龄幼虫肠道不同部位和幼虫不同龄期的转录表达谱。结果表明,该基因在幼虫中肠中的表达量最高,其次为后肠,前肠中表达量最低,且中肠和后肠中的表达量显著高于前肠(P<0.05);SiAPN3在3龄幼虫中的表达量最高,1龄幼虫中最低,虽然3、4日龄之间的表达量没有显著差异,但二者均显著高于其他日龄,1,2和5日龄之间不存在显著差异(P>0.05)。该研究为阐明APN基因的功能及大螟对Bt抗性产生的分子机制奠定了基础。

小菜蛾PxALP1基因的时空表达谱分析

小菜蛾是最早对Bt毒蛋白产生抗性的重要农业害虫之一,而膜结合碱性磷酸酶是小菜蛾体内疑似Bt毒蛋白的直接受体之一。我们在之前的工作中克隆了小菜蛾碱性磷酸酶编码基因PxALP1,本研究对该基因的时空表达谱进行了分析。在小菜蛾所有生命阶段中,PxALP1基因在3龄幼虫中表达水平最高;而在小菜蛾3龄幼虫不同组织中,PxALP1基因在中肠中表达水平最高,这些都可能与PxALP1基因对Bt毒蛋白产生抗性的生物学功能密切相关。

稻纵卷叶螟氨肽酶N基因的克隆及时空表达分析

【目的】昆虫中肠氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)是Bt杀虫蛋白的重要受体之一,与Bt蛋白的杀虫机制及昆虫对Bt蛋白的抗性密切相关。为阐明稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis(Guenee)APN基因的功能及明确Bt蛋白对稻纵卷叶螟的毒力机制,本研究系统开展了稻纵卷叶螟中肠APN基因的克隆及时空表达分析。【方法】通过简并引物PCR结合RACE技术克隆并获得4条稻纵卷叶螟APN基因的cDNA序列全长,采用实时定量PCR技术研究了APN基因在稻纵卷叶螟不同虫态及幼虫不同组织中的时空表达情况。【结果】经NCBI同源比对分析,认为这4个基因分属于。4PN基因家族的不同类别,分别将其命名为CmAPN1(GenBank登录号:HQ853294)、CmAPN2(GenBank登录号:HQ853295)、CmAPN3(GenBank登录号:KJ143755)、CmAPN4(GenBank登录号:HQ853296)。序列分析表明,CmAPN1-4 cDNA序列全长分别为:3 698、3 478、3 150和3 149 bp,开放阅读框分别为:3 045、2 877、3 045和2 862 bp,分别编码965、958、1 014和952个氨基酸。其推导的氨基酸序列具有鳞翅目昆虫氨肽酶N的典型结构特征,即含有糖基化位点、N-末端信号肽序列、谷氨酸锌化氨肽酶保守结构GAMEN、锌结合位点HEX_2HX_(18)E、C-末端糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚信号肽。实时定量研究表明,CmAPNs在幼虫中的表达量显著高于卵、蛹和成虫;在幼虫中,CmAPN7的表达水平明显低于CmAPN22-4,且其在不同龄期中的表达差异显著;CmAPN2-4的表达量随幼虫龄期的增加而增加;CmAPNs在幼虫肠道组织中的表达量显著高于其它组织器官,且CmAPN1和CmAPN2分别在中肠和后肠中呈现高水平表达,CmAPN3在前、中肠内均高水平表达;但CmAPN4在各个组织器官中的表达均保持较低水平。【结论】CmAPNs基因在稻纵卷叶螟的不同虫态和不同组织中呈现了差异显著的时空表达,采用RNA干扰方法进行CmAPNs基因功能研究时,要选择适宜的虫态和虫龄进行干扰。