转基因玉米Bt176品系特异性环介导等温扩增检测方法的研究

根据转基因玉米品系Bt176外源插入片段与玉米基因组序列设计和筛选品系特异性引物,并对反应体系和反应条件进行优化,最终建立转基因玉米品系Bt176的品系特异性LAMP检测方法。对该方法进行了灵敏度、特异性和稳定性评价。评价结果表明:该方法定性检测低限为0.5%,特异性和稳定性均达到100%。

用实时荧光PCR方法定量检测Bt176转基因玉米

以实时荧光PCR技术鉴定商业化种植的转基因玉米Bt176品系。根据转基因玉米Bt176中内源基因Zein和外源基因cry1Ab设计引物及TaqMan荧光探针,成功建立了检测转基因玉米Bt176品系的实时荧光PCR方法。结果表明,应用实时荧光PCR方法检测转基因作物,不仅可以达到品系鉴定的作用,而且可以用于转基因成分的检测。该方法简便迅速,降低了污染机会,为转基因作物及产品的品系检测提供了新方法。

玉米粉中转基因Bt176玉米的定量检测

使用根据转基因Bt176玉米中的外源基因CryIA(b)和内源基因Zein设计的引物和TaqMan荧光探针和ABIPRISM 770 0定量PCR仪对玉米粉中Bt176玉米的含量进行了定量检测 ,建立了Bt176玉米参照样品CryIA(b)和Zein的Ct值之差与样品中Bt176玉米含量之间的标准曲线和线性回归方程 。

实时荧光定量PCR检测转基因玉米Bt176测量不确定度分析

应用实时定量PCR方法测定样品中转基因玉米Bt176的含量,并从多个方面来分析测量的不确定度。结果显示,A类不确定度为0.0003,B类不确定度为0.0007,合成不确定度为0.001,有效自由度veff为272,包含概率P为95%,扩展不确定度U=0.002,测量结果为(0.8±0.2)%。不确定度评估结果表明,测量不确定度的主要来源是微量液体转移量的偏差。

转基因玉米Bt176液相芯片检测方法的建立

为建立转基因玉米Bt176的液相芯片检测方法,根据已公布的转基因玉米Bt176外源插入基因CaMV35S启动子序列,外源基因3'端与玉米基因组DNA连接区序列,同时以玉米特异Zein内源基因序列为参照,利用Primer Premier5.0等软件设计特异性引物和探针。将探针与荧光编码微球偶联后,与PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Bio-plex 200)检测荧光信号。检测结果显示,该方法具有高特异性及灵敏度,各条探针之间无交叉反应,最低检测限可达0.01%。初步建立了检测转基因玉米Bt176的液相芯片技术,为其他转基因作物的快速高通量检测提供了借鉴和经验。

转基因玉米Bt176细胞毒性及遗传毒性研究

利用细胞-遗传毒理学技术评价转基因玉米Bt 176细胞毒性及遗传毒性,分别以200,100,50,25,12.5mg·L-1转基因玉米Bt 176全蛋白质作用于人淋巴细胞,并各孵育1.5,6,24 h.检测其细胞毒性损伤及遗传毒性损伤,并与空白组、阳性对照组、非转基因玉米组相比较.结果表明,阳性组与空白组淋巴细胞的遗传及细胞损伤指标存在显著差异.转基因玉米组淋巴细胞遗传及细胞损伤指标与非转基因玉米组淋巴细胞相比无明显差异(P>0.05),且与空白剂组细胞差异不显著(P>0.05).结果还表明,转基因玉米Bt 176与非转基因玉米两者在遗传毒性及细胞毒性上性状相似,实质等同.

玉米样品中转基因玉米Bt176含量检测

根据其检测特异性,转基因产品检测技术可分为筛选、基因、构建和转化体特异性检测四类。由于转化体特异性检测方法的具有高度特异性,目前,一些发达国家对于转基因产品检测方法正逐步过渡到转化体特异性序列的检测方法。本研究针对转基因玉米Bt176的外源基因3'端与玉米基因组DNA相接区序列设计具有转化体特异性的引物和荧光探针。利用实时荧光定量PCR,以已知Bt176含量样品为标准样品建立内外源基因标准曲线,利用该标准曲线对多个玉米样品Bt176玉米成分含量进行检测,结果显示该方法检测结果准确,检测特异性强,Bt176玉米检测极限浓度达到0.001ng/μL。同时该方法操作简单,适合转基因样品大批量检测。

PCR法检测食品和动物饲料中的转基因成分

目的初步调查广州市场上含大豆及玉米原料的食品和饲料中转基因成分的存在情况。方法通过PCR检测camv35S启动子和nos终止子,筛选食品中是否含转基因成分,并进一步通过PCR检测RoundUpReadyTMSoybean(RRS)、Bt176Maximaizer和Mon810YieldGard的特异DNA片段,判断是否含这三种成分。结果从22份市售食品和3份动物饲料,检测出1份玉米汤和2份鲜黄豆样品、1份薯条、及1份大鼠和1份豚鼠饲料中含转基因成分;其中的阳性鲜黄豆和饲料样品含有RRS,而阳性玉米汤和饲料样品中未检测到Bt176Maximaizer和Mon810YieldGard。结论部分未标识市售食品和动物饲料中含转基因成分。

Chelex-100快速提取用于转基因检测DNA模板的研究

目的:建立从转基因作物中快速提取DNA的方法。方法:采用Chelex-100法提取抗草甘膦大豆和非转基因大豆、转基因抗虫玉米Bt176和非转基因玉米中的DNA,使用PCR扩增大豆和玉米的内源基因(Lectin,zSSIIb)及外源特异性序列(CaMV35S,Bt176)评价提取核酸的质量。结果:Chelex-100法能够快速在1h之内从大豆和玉米中提取DNA,所提取的DNA可以直接用于PCR扩增反应,PCR扩增产物电泳条带清晰,转基因抗草甘膦大豆样品和转基因抗虫玉米Bt176检测均出现强阳性结果。结论:Chelex-100法提取DNA可以作为转基因检测的模板,该方法具有经济、简便、快速的特点,适合于转基因检测工作。

转基因玉米中膦丝菌素乙酰转移酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

【目的】以单克隆抗体（monoclonal antibody,mAbs）为基础，建立检测膦丝菌素乙酰转移酶（the phosphinothricin acetyltransferase,PAT）的双抗体夹心ELISA方法,为转基因玉米PAT蛋白的检测提供参考。【方法】由P3301质粒扩增出膦丝菌素乙酰转移酶基因（blalaphos resistance gene）bar，并与表达载体pET28a构建重组质粒，诱导表达产生外源性PAT蛋白；以纯化后的PAT蛋白为免疫原，制备mAbs，建立双抗体夹心ELISA方法，并与PCR检测方法进行比较，确定该方法的准确性和可靠性。【结果】应用mAbs 4D5和3E8成功建立了检测PAT蛋白的双抗体夹心ELISA方法，其有效检测范围为3.125～50 ng/mL。采用该夹心ELISA方法对36份已知转基因背景的玉米样品进行了检测，根据阴阳性判定值OD450〉0.210，检测出含PAT蛋白的Bt176阳性样品4份，以bar基因为检测目标利用传统PCR方法也检测出相同的Bt176样品4份，2种检测方法的符合率为100%。【结论】利用建立的双抗体夹心ELISA免疫学检测方法，可以对转基因玉米中的PAT蛋白进行准确、特异、有效的检测。

玉米加工产品中转基因成分的定量检测

[目的]建立检测玉米加工产品中转基因成分的实时荧光定量PCR技术。[方法]根据转基因Bt176玉米中的外源基因和内源基因设计的引物和TaqMan荧光探针,使用实时定量PCR技术对转基因成分含量进行了定量检测,建立了Bt176玉米参照样品的外源基因和内源基因Ct值之差与转基因成分含量之间的标准曲线和线性回归方程,并对采自市场的未知样品进行了检测。[结果]在1份玉米粒样品中检测到了Bt176玉米转基因成分。检测灵敏度达到0.01%。[结论]实时荧光定量PCR技术检测方法是灵敏和准确的,可以广泛地应用到转基因作物及其加工产品的转基因成分检测中。