盐析法快速提取口腔拭子DNA

目的建立盐析法快速从口腔拭子中提取基因组DNA的方法。方法首先以细胞裂解液和蛋白酶K消化口腔上皮细胞,然后用5 mol/L NaCl沉淀蛋白质,用异丙醇沉淀DNA,最后用70%乙醇洗涤得到的DNA并将其溶于TE(10mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)中。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对TP53基因的rs1042522和CHRNA3基因的rs12910984位点进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果单支口腔拭子提取得到的DNA量在0.68～2.56μg之间,D260/D280比值在1.77～1.94之间。经PCR扩增和酶切消化,10个样本的两个单核苷酸多态性都得到了清楚分型。酶切结果与测序结果吻合。结论本实验所建立的盐析法可以快速、简便、经济地从口腔拭子得到高质量的基因组DNA。

Chelex-100法从颊粘膜拭子提取DNA进行基因型分析的研究

目的 :探讨采用Chelex 10 0法从颊粘膜拭子提取DNA这一方法的有效性和可靠性。 方法 :用棉签刮取 130例个体口腔颊粘膜脱落细胞 ,采用Chelex 10 0法从颊粘膜拭子中提取DNA ,采用SSP PCR及PCR PFLP法对其进行检测 ,观察结果的有效性和可靠性。 结果 :所有样本中都获得成功。电泳结果显示 ,PCR扩增及酶切的靶带清晰 ,无非特异性杂带 ,扩增结果重复性好。 结论 :采用Chelex 10 0法从颊粘膜拭子提取DNA ,方法稳定可靠 ,可以用于基因型检测。

颊拭子样本检测牙周炎相关基因的应用

目的 探讨采用颊黏膜拭子抽提DNA分析Fcγ受体 (FcγR)IIIA、基质金属蛋白酶 (matrixmetalloproteinase ,MMP) - 9基因多态性的可行性。方法 分别提取 10例慢性牙周炎患者静脉血和颊黏膜拭子DNA ,采用限制性内切酶酶切片断长度多态性 (PCR -RFLP)技术 ,检测FcγRIIIA - 15 8和MMP - 915 6 2基因多态性并进行比较。结果 颊黏膜拭子抽提DNA与静脉血抽提DNA用于分析FcγRIIIA、MMP - 9基因多态性的结果完全一致。结论 颊黏膜拭子具有无创、方便的特点 ,所抽提DNA适于FcγRIIIA、MMP -

碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用。方法以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA。以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带。酶切结果与测序结果吻合。结论碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析。

口腔拭子在药物性耳聋基因检测中的应用

目的:探讨口腔黏膜上皮细胞基因组DNA在药物性耳聋基因A1555G及C1494T突变检测中的应用,寻求基因检测中更简单快捷并无损的样本来源。方法:采集97例来自温州特殊教育学校非综合征型耳聋学生的口腔拭子和外周血,分别提取基因组DNA,进行浓度与纯度的测定、基因扩增及产物测序,比较2种样本来源及2种方法提取的基因组DNA的浓度、纯度、扩增成功率,并将测序结果与人类线粒体DNA剑桥参考序列进行比对。结果:口腔拭子DNA的手工法提取浓度(42.5±41.7)ng/mL与试剂盒法DNA浓度(44.8±43.4)ng/mL差异无统计学意义(P>0.05);手工法DNA纯度(1.45±0.73)低于试剂盒法(1.87±0.87),两组间差异有统计学意义(P<0.05);二者扩增成功率与外周血差异均无统计学意义(P>0.05);口腔拭子DNA的药物性耳聋基因扩增产物长短一致,测序结果完全相符,均显示A1555G突变阳性2例,阴性95例;C1494T突变97例均阴性。结论:无损性样本口腔拭子扩增成功率高,诊断结果可靠,可替代外周血作为药物性耳聋基因检测的DNA来源,具有一定的临床应用价值。

颊粘膜拭子检测孤独症谱系障碍儿童相关基因多态性的临床应用

目的探讨应用颊粘膜拭子采集样本以提取DNA进行孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)相关基因检测的可行性。方法纳入41例ASD患儿。采用棉拭子擦拭患儿颊粘膜,酚-氯仿-异戊醇法抽提基因组DNA;另采集患儿外周静脉血,用试剂盒提取基因组DNA。比较两种取材方法获得的基因组DNA总量、浓度与纯度。应用PCR-限制性酶切法对亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetra-hydrofolate reductase,MTHFR)基因C677T位点进行基因型分析,比较两种取材法获得的基因分型结果一致性。结果从颊粘膜提取的基因组DNA总量([5.87±2.58)μg vs(.2.00±0.92)μg]与浓度([143.25±72.78)mg/L vs(.66.68±24.43)mg/L]高于200μL血液提取的基因组DNA(P<0.01),而纯度与血液样本比较差异无统计学意义(P<0.05)。两种取材法进行MTHFR基因分型结果完全一致,并经Sanger测序验证。结论颊粘膜拭子是一种简单、无创、可靠的获取基因组DNA方法,可部分替代静脉血进行ASD相关基因多态性分析。

儿童氨基糖苷类药物性耳聋基因快速无创检测法的应用

目的:探讨氨基糖苷类药物性耳聋相关基因位点A1555G和C1494T的快速无创检测法在儿童耳聋诊断中的应用。方法:选取2015年5月至2017年5月温州医科大学附属第一医院诊断为非综合征型感音神经性耳聋患儿126例,收集其口腔黏膜拭子及静脉血。采用多重等位基因特异性PCR(MAS-PCR)检测口腔拭子来源DNA中A1555G和C1494T突变情况。同时用Sanger测序法检测静脉血来源DNA中A1555G和C1494T突变情况,并通过Kappa一致性检验分析2种方法检出率的一致性来验证前者的可靠性。结果:采用MAS-PCR检测口腔黏膜拭子来源DNA中A1555G和C1494T突变的检出率为6.35%(8/126),其中A1555G突变7例、C1494T突变1例。静脉血Sanger测序法的检出率为6.35%(8/126),Kappa一致性检验结果显示2种方法检出率一致性较好(kappa=1,P<0.01)。结论:采用MAS-PCR检测口腔黏膜拭子来源DNA中A1555G和C1494T突变是一种简便、快速、无创的检测手段,为婴幼儿,乃至新生儿药物性耳聋检测的开展提供一种可行的方法。

Leber遗传性视神经病相关的三种原发性线粒体突变的无创检测方法建立

目的:建立1种Leber遗传性视神经病(LHON)相关的3种原发性线粒体突变11778G>A、14484T>C和3460G>A的无创检测方法。方法:研究对象为在温州医科大学附属眼视光医院就诊的3例(WZ1481、WZ1478、WZ1435)基因检测确定为m.11778G>A、m.14484T>C和m.3460G>A突变的LHON患者。采集3例LHON患者和2例野生型健康对照的静脉血样及口腔黏膜细胞样本,然后分别用手工法和试剂盒法提取全基因组DNA,分析比较2种样本、2种方法提取的DNA的纯度及浓度有无差别。最后以携带m.11778G>A、m.14484T>C和m.3460G>A突变的LHON患者和野生型的口腔黏膜细胞和外周血提取的全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增分别包含以上3种突变的DNA片段,然后进行焦磷酸测序、斑点杂交和Southern blot分析PCR产物。结果:口腔黏膜细胞和血液提取的DNA浓度的差异无统计学意义(P>0.05)。手工法提取的口腔黏膜细胞DNA纯度低于试剂盒法提取的口腔黏膜细胞和血液DNA的纯度,差异有统计学意义(P<0.05)。口腔黏膜细胞提取的DNA产量与血液相似。DNA测序结果显示血液样本和口腔黏膜细胞样本具有很好的一致性,对照组均检测不到突变,而突变组可以检测到相应的突变。斑点杂交和Southern blot的结果也一致,对照组均为阳性而突变组均为阴性。结论:口腔黏膜细胞DNA可用于筛查和鉴定LHON的3个主要线粒体突变。本研究建立了一种方便、无创的方法来检测LHON相关的m.11778G>A、m.14484T>C和m.3460G>A突变。

基于PCR-金磁纳米微粒层析技术检测乙醛脱氢酶2基因多态性方法的建立及应用

目的基于"PCR-金磁纳米微粒层析法"建立用于口腔拭子样本类型的乙醛脱氢酶2(ALDH2)Glu504Lys基因分型检测技术。方法以口腔拭子为样本类型,利用ARMS-PCR技术,针对ALDH2 Glu504Lys基因设计特异性引物,在实验室PCR常规反应条件上以金磁纳米层析试纸条为检测平台对各项条件进行优化,以确定最优PCR-金磁微粒ALDH2Glu504Lys口腔拭子反应体系和PCR反应程序。收集60例口腔拭子样本,利用金磁纳米层析检测技术进行检测,并用测序结果进行验证。结果检测的60例口腔拭子样本中杂合突变型16例,野生型42例,纯合突变型2例,金磁微粒层析法检测基因分型结果与测序结果符合率100%。结论建立了基于金磁纳米微粒ALDH2 Glu504Lys口腔拭子基因检测技术,该方法具有快速、简便和准确的特点,迎合了当下POCT的发展趋势,值得临床推广和应用。

口腔黏膜拭子法可用于无创检测线粒体tRNA^Thr15927G>A突变

目的探索口腔黏膜拭子法在临床上检测母系遗传性线粒体tRNA^Thr15927G>A(m.15927G>A)突变的可行性。方法对温州医科大学附属第一医院2070例母系遗传性线粒体疾病病例进行测序筛选,获得3例携带m.15927G>A突变病例(突变组)和3例正常志愿者(对照组)的口腔黏膜样本和血液样本。提取样本全基因组DNA后进行DNA浓度和纯度分析,再对其PCR产物进行斑点印迹杂、Southern blot印迹杂交和DNA测序分析,以验证口腔黏膜拭子法检测m.15927G>A突变的可行性。结果突变组和对照组口腔黏膜样本和血液样本提取的DNA浓度无显著差异(P>0.05),而手工法提取的口腔黏膜DNA纯度显著低于试剂盒法提取的血液及口腔黏膜DNA纯度(P<0.05)。斑点印迹杂交和Southern Blot印迹杂交提示对照组均呈阳性结果,而突变组均呈阴性结果。DNA测序结果示突变组中均可检测到m.15927G>A突变。结论口腔黏膜拭子法是一种准确、灵敏的无创检测m.15927G>A突变的方法,具有较高的临床应用价值。

口腔黏膜拭子在遗传性耳聋常见致病基因检测中的应用研究

目的：探讨口腔黏膜拭子在遗传性耳聋常见致病基因检测中的应用，为常见耳聋致病基因筛查提供无创的样本采集方式。方法：195例新生儿，经听力筛查被诊断为听力障碍，收集其口腔黏膜拭子和外周血样本，抽提DNA，核酸测定仪检测两种收集方式样本所得DNA质量。对两种样本进行三种常见遗传性耳聋致病基因GJB2基因、SLC26A4基因和线粒体基因12S rRNA全外显子巢式PCR扩增，比较两种方法扩增产物及测序效果。结果：口腔黏膜拭子抽提DNA质量较外周血低，差异具有统计学意义（P〈0．05）；在PCR扩增后，两种样本扩增产物凝胶电泳无明显差异，测序结果无明显差异（P〉0．05）。结论：口腔黏膜拭子作为一种无创的样本采集方式，可用于三种常见遗传性耳聋致病基因检测的样本采集。

3种常见PCR扩增试剂盒对陈旧口腔拭子检验效率比较

目的比较GlobalFiler、PowerPlex 21及Identifiler Plus3种PCR扩增试剂盒对陈旧口腔拭子的检验效率。方法采用硅珠法提取150份保存7-13年陈旧口腔拭子的DNA,分别用GlobalFiler、PowerPlex 21及Identifiler Plus试剂盒进行扩增检测,比较分析所得分型数据。结果在150份降解样本的检验结果中,GlobalFiler试剂盒21个常染色体STR基因座有效分型检出率为76%,PowerPlex 21试剂盒20个STR基因座检出率为74.93%,Identifiler Plus所含的15个STR基因座检出率为77.56%。结论对于陈旧口腔拭子检材,Identifiler Plus检验成功率最高,需要更多基因座时,GlobalFiler优于PowerPlex 21。

上海市中青年人群在造血干细胞采集中口腔黏膜拭子的接受意愿及其影响因素

目的:调查中青年人群在造血干细胞采集中口腔黏膜拭子的接受意愿及其影响因素,为口腔拭子采样工作的开展提供建议。方法:对接受口腔拭子采样的志愿者进行调查,采用单因素分析和logistic回归分析口腔拭子采样入库接受意愿及影响因素。结果:共收集有效问卷1985份,志愿者口腔拭子采样入库的接受率为96.83%;口腔拭子接受意愿在职业、排队等候时间、对口腔拭子技术的认知、采集操作难度、与现场指导人员沟通难度上的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:口腔拭子采样社会接受度较高,受职业、认知等因素影响。

上海市造血干细胞捐献志愿者口腔拭子样本的分型成功率及其影响因素

目的:了解上海市造血干细胞捐献志愿者的口腔拭子样本分型成功率情况,分析其影响因素,为提高口腔拭子样本分型成功率提供参考。方法:利用2015-2018年上海市口腔拭子入库志愿者的8104条口腔拭子样本检测结果和造血干细胞资料库信息,对不同年份、不同采样方式获得的样本分型成功率进行卡方分析,并对口腔拭子样本分型结果的影响因素进行回归分析。结果:2015-2018年,造血干细胞入库志愿者的口腔拭子样本分型成功率逐年上升(P<0.05),2018年的口腔拭子样本与静脉血样本在分型成功率上无差异(P>0.05);logistic回归分析显示,样本分型的有效性在户籍、献血经历与采集检测的时间间隔上差异有统计学意义(P<0.05),送检时间间隔较短、上海户籍以及没有献血经历的志愿者口腔拭子样本具有更高的分型成功率。结论:口腔拭子样本的分型成功率较为理想;志愿者户籍、献血经历和采集检测时间间隔是影响口腔拭子样本分型结果的主要因素,需要优化关键环节来保障口腔拭子技术的有效应用。