酶法水解荞麦清蛋白制备抗氧化活性肽的研究

以水解度和对O·清除率为指标,采用正交试验对碱性蛋白酶酶解荞麦清蛋白工艺进行探索,实验结果表明,最佳工艺为:温度50℃、pH10.0、底物浓度20g/L、酶与底物比为10%。在此条件下水解,水解度可达17.57%,对O·清除率达37.06%。对酶解产物进行Sephadex G-25柱层析分离,得到组分Ⅰ和组分Ⅱ。其分子量范围分别为20.89～204.2kD,219～691D。组分Ⅰ和组分Ⅱ对O·、·OH、DPPH·三种自由基的清除能力要强于清蛋白酶解产物,且组分Ⅱ的清除能力最强。组分Ⅱ对三种自由基清除能力表现为O·>·OH>DPPH·,其IC50分别为:0.072、0.19、0.32mg/ml。

甜荞各分离蛋白清除活性氧自由基的研究

采用Osborne蛋白质分离法分级提取荞麦中的清蛋白、球蛋白和谷蛋白,并对其清除羟自由基、超氧自由基的能力进行测定。结果表明,荞麦清蛋白具有很强的清除羟自由基、超氧自由基的能力,其IC50分别为0.474g/L和0.436g/L;荞麦球蛋白只对羟自由基具有清除作用,其IC50为2.19g/L;而荞麦谷蛋白则对两种自由基均无清除效果。

甜荞蛋白质组分的物化特性研究

研究甜荞不同蛋白组分的物化特性。采用分步提取法分离收集甜荞清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。结果表明:甜荞清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的含量分别占总蛋白的21.91%、19.36%、2.26%和19.95%,等电点分别为pH4.40、5.00、4.80和4.60,变性温度分别为79.39℃、70.36℃、80.04℃和83.09℃,前三种蛋白白色略偏黄,而谷蛋白偏红色。甜荞清蛋白、球蛋白和谷蛋白的必需氨基酸含量丰富。甜荞清蛋白含铁量高,醇溶蛋白含锌量高,球蛋白含镁量高,而铅、锡、砷在各蛋白质组分中的含量均很低。

Suppression of postprandial blood glucose elevation by buckwheat(Fagpopyrum esculentum) albumin hydrolysate and identification of the peptide responsible to the function

The objective of this study is to evaluate the suppressive effect of buckwheat-albumin hydrolysate on postprandial hyperglycemia and identify the peptide responsible to the function. Buckwheat-albumin hydrolysate was prepared by using digestive enzymes and was orally administered to rats together with soluble starch. The blood was taken from the tail vein up to 90 min after oral administration to measure blood-glucose and plasma-insulin levels. The peptide with α-amylase inhibitory activity was purified from the buckwheathydrolysate by gel-filtration chromatography, α-amylase affinity chromatography, and high performance liquid chromatography(HPLC). The amino-acid sequence of the peptide was identified by a protein sequencer and was compared with that in the buckwheat-genome database. Buckwheat-albumin hydrolysate significantly suppressed the elevation of blood glucose level 15 min after starch administration. The amino-acid sequence of the peptide with α-amylase inhibitory activity was YVEPDCGNLGCCYHC in the parental protein of molecular mass 17.8 k Da and theoretical pI 4.77. The amino-acid sequence, molecular weight, and pI of the parental protein in buckwheat albumin were different from those of α-amylase inhibitor in wheat albumin. This study suggests that the novel α-amylase inhibitor identified in buckwheat albumin is a potential candidate for a functional food material to suppress postprandial blood glucose elevation.

荞麦清蛋白水解物理化性质及抗氧化性研究

本试验研究了木瓜蛋白酶作用下,不同酶解时间对荞麦清蛋白物化及抗氧化能力的影响,包括了对酶解产物多酚含量、表面疏水性的测定以及DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力。结果表明,酶解做用后,荞麦清蛋白的多酚含量及表面疏水性有很大程度的改变,另外,荞麦清蛋白具有良好的抗氧化能力,其DPPH自由基和羟自由基清除能力在蛋白浓度为1 mg/mL时分别可达到为60%及80%,接近抗氧化剂2,6-二叔丁基对苯酚(BHT)的抗氧化能力,而酶解产物的抗氧化能力有所降低。

苦荞清蛋白酶解物对高糖诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗的保护作用

目的:建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型,观察苦荞清蛋白酶解物(tartary buckwheat albumin hydrolysate,TBAH)对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响。方法:采用碱性蛋白酶水解苦荞清蛋白制备TBAH,超滤法截留分子质量小于3 kDa的TBAH;利用高糖高胰岛素诱导HepG2细胞36 h建立胰岛素抵抗模型,以2.5、5、10μg/mL的TBAH培养细胞24 h。观察TBAH对HepG2细胞葡萄糖代谢的影响;检测细胞氧化损伤指标(一氧化氮(nitric oxide,NO)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和活性氧(reactive oxygen species,ROS))水平;Western blot检测胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路中相关蛋白表达情况。结果:与IR模型组相比,TBAH组葡萄糖消耗量显著增多(P<0.05),且呈剂量依赖性,同时MDA、NO和ROS水平显著降低(P<0.01,P<0.05),SOD活力显著升高(P<0.05),LDH活力显著下降(P<0.05);p-IRS-1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),磷酸化Akt、PI3K、葡萄糖转运蛋白4表达水平极显著上升(P<0.01)。结论:TBAH通过抑制氧化应激改善胰岛素抵抗。

响应面法优化苦荞麦水溶性清蛋白提取工艺研究

研究通过Osborne分级法对苦荞麦中的清蛋白进行提取,选择提取清蛋白的料液比、搅拌时间、搅拌温度为单因素,以清蛋白提取率为指标。在单因素的研究基础上,采用三因素三水平的设计方法,利用响应面法优化苦荞麦水溶性清蛋白提取工艺,确定苦荞麦清蛋白最佳提取工艺为:料液比1∶19.48(g/mL)、搅拌时间59.84 min、搅拌温度35.05℃。考虑其实际操作方便,将上述条件更正为料液比1∶20(g/mL),搅拌时间60 min,搅拌温度35℃,在此条件下蛋白提取率为35.86%,与预测值36.16%接近。

响应面法优化苦荞水溶性清蛋白水解工艺及其抗氧化活性研究

以贵州威宁苦荞为原料,采用Osborne法分级提取苦荞水溶性清蛋白,并采用碱性蛋白酶对其进行水解,制备苦荞水溶性清蛋白多肽,以水解度(DH)为指标,采用单因素实验和响应面法对水解工艺进行优化,并研究其体外抗氧化能力。结果表明:苦荞清蛋白水解最佳条件为:p H9.1、温度45℃、时间3.5 h,在此条件下水解度为27.52%。与苦荞水溶性清蛋白相比,以最佳工艺制备得到的苦荞水溶性清蛋白多肽具有更好的抗氧化能力,其清除超氧自由基的IC_(50)为2.17mg/m L,清除超氧自由基的能力为96.0018 U/g(p<0.01);清除DPPH自由基的IC_(50)为0.535 mg/mL。结论:经过水解制备的多肽具有更好的抗氧化能力,可为苦荞水溶性清蛋白进一步深入开发利用提供科学依据。

苦荞清蛋白酶解物对2型糖尿病小鼠血糖血脂的作用

实验建立了链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的C57/BL6小鼠糖尿病动物模型,研究苦荞清蛋白酶解物(Tartary buckwheat albumin hydrolysate,TBH,3 ku<MW<10 ku)对STZ诱导的C57/BL6小鼠糖尿病动物模型的影响。采用碱性蛋白酶水解苦荞清蛋白制备TBH,超滤法截留3 ku<MW<10 ku的TBH;采用50 mg/kg STZ剂量连续3 d腹腔注射C57/BL6小鼠,建立糖尿病动物模型。TBH(20 mg/kg~.d)剂量连续灌胃4周后,研究各组小鼠血糖、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、极低密度脂蛋白(VLDL)、肾功能及血清相关炎症因子变化。结果表明:与胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)模型组相比,TBH组的血糖下降51.58%(P<0.01)、TG下降41.66%(P<0.01)、TC下降34.16%(P<0.01)、LDL-C下降58.25%(P<0.01)、VIDL下降47.06%(P<0.01),HDL-C含量显著增高45.34%(P<0.01);与空白组比较,模型组血清IL-6增高71.58%(P<0.05)、TNF-a增高81.16%(P<0.01)、CERA增高32.82%(P<0.01)、BUN增高57.02%(P<0.01),肝脏组织中TG增高38.7%(P<0.05)、TC增高62.71%(P<0.05),而通过TBH干预4周以后,相对于模型组,TBH组血清IL-6下降66.09%(P<0.05)、TNF-a下降70.28%(P<0.01)、CERA下降50.92%(P<0.01)、BUN下降27.4%(P<0.01),肝脏组织中TG下降38.7%(P<0.05)、TC下降48.3%(P<0.01)。说明TBH具有降低糖尿病小鼠血糖、血脂,改善糖尿病并发症的作用。