基于UPLC-MS/MS技术检查银柴颗粒中柴胡掺伪的鉴别研究

目的:建立银柴颗粒中藏柴胡的检查方法,考察生产企业是否存在使用藏柴胡代替柴胡投料的现象。方法:采用高效液相色谱-质谱法,选择Agilent Eclipse Plus C18(100 mm×3 mm,1.8μm)色谱柱;流动相为乙腈(A)-水(B),二元梯度洗脱,流速0.3 mL·min^(-1),柱温40℃;采用质谱检测器,电喷雾负离子模式(ESI-),进行多反应监测(MRM),选择m/z 943.5→797.5、m/z 943.5→635.4和m/z943.5→781.5为检测离子对。结果:尼泊尔柴胡皂苷K在0.1~5μg·mL^(-1)浓度范围与峰面积呈现出良好的线性关系(r=0.9920),仪器精密度RSD(n=6)为0.57%,样品重复性RSD(n=6)为0.95%。以掺杂藏柴胡不得过10%为限度,对27批银柴颗粒样品进行筛查,结果4批银柴颗粒分别掺杂藏柴胡59%、21%、32%、71%,超过拟定限度。结论:该方法经过方法学验证,灵敏、准确,可作为银柴颗粒中柴胡掺杂藏柴胡的检查方法,为打击藏柴胡掺伪提供有力技术支持。

窄竹叶柴胡内参基因筛选及皂苷合成关键酶基因表达分析

窄竹叶柴胡(Bupleurum marginatum var.stenophyllum)为柴胡属多年生高大型草本植物,以根入药称为藏柴胡,具有较高的药用价值。本试验采用实时荧光定量PCR技术,利用geNorm、NormFinder及BestKeeper3种不同数据分析软件,从5个常用的候选基因(Actin,α-tubulin,β-tubulin,Cyclophilin,EF-1α)筛选出可在窄竹叶柴胡不同器官稳定表达的基因作为内参基因,并利用筛选得到的内参基因分析皂苷合成关键酶基因(HMGR,IPPI,FPS,SS,β-AS)在窄竹叶柴胡不同器官的相对表达量。结果表明β-tubulin基因可作为窄竹叶柴胡不同器官稳定表达的内参基因;皂苷合成关键酶基因在窄竹叶柴胡的不同器官中表达量有显著差异,IPPI基因在种子中表达量最高,其他基因在根中的表达量均高于在其他器官中的表达量,其中HMGR,FPS,SS在侧根的表达量高于主根。因此,窄竹叶柴胡各器官皂苷合成关键酶基因的表达量不同,最适内参基因为β-tubulin基因,本研究为窄竹叶柴胡分子生物学研究提供一定依据,促进其合理开发和利用。

藏柴胡研究概况

藏柴胡是近年来主要种植于甘肃省定西市等地区的一种柴胡的习称,其产量和柴胡皂苷含量显著高于柴胡Bupleurum chinense DC.和狭叶柴胡B.scorzonerifolium Willd。藏柴胡虽非《中华人民共和国药典》2020年版收载品种,但混为北柴胡使用。对藏柴胡种植情况、来源、形态特征、化学成分、药理毒理、药用标准等进行综述,旨在为正确认识和利用藏柴胡提供参考。

感冒清热颗粒中藏柴胡检查方法的研究

目的:建立感冒清热颗粒中藏柴胡的检查方法,考察柴胡的掺伪情况。方法:采用液相色谱-串联质谱法,选择Agilent Poroshell 120 EC-C_(18)(100 mm×3.0 mm,2.7μm)色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^(-1),柱温35℃,进样量5μL;采用电喷雾离子源(ESI),选择m/z 943.5→797.5、m/z 943.5→781.2和m/z 943.5→635.5为尼泊尔柴胡皂苷K检测离子对,以多反应监测(MRM)模式进行测定。结果:尼泊尔柴胡皂苷K质量浓度在0.049~4.866μg·mL^(-1)范围内线性关系良好(r=0.9999),精密度、重复性良好(RSD分别为1.42%、2.24%)。以0.8μg·mL-1为掺伪判定浓度,220批感冒清热颗粒中有17批样品溶液尼泊尔柴胡皂苷K的浓度为1.2~3.5μg·mL^(-1),判定为检出藏柴胡,不合格率7.7%。结论:建立的方法准确、可靠,可用于感冒清热颗粒中柴胡的掺伪检查及市场监管。

中国青海省和西藏自治区柴胡属(伞形科)药用植物资源的调查和利用

柴胡为著名的常用中药,近年来需要量日增,而药典规定的正品柴胡资源日渐减少,急待开发新药源。中国伞形科柴胡属有40种以上,其中有很多种在产地或民间早已作柴胡药用,本文报道青海省和西藏自治区调查柴胡资源和利用的情况,发现共有柴胡属植物18种7变种和1变型,其中1种为首次发现的新种,订名为青海柴胡Bupleurum qinghaiense Y.Li et J.X.Guo,Sp.Nov.并按国际命名法作了拉丁文植物描述。调查在当地作为柴胡药用的共有三种,即青海柴胡、小叶黑柴胡 Bupleurum smithii Wolff.var.parvifolium Shan et Y.Li、窄竹叶柴胡 Bupleurum margmatum Wall.ex DC.vat.stenophyllum(Wolff)Shan etY.Li 作者对此三种药用柴胡进行分类学研究、挥发油含量测定和柴胡皂甙的初步分析为今后开发利用这些资源提供了有价值的科学依据。

小叶黑柴胡与窄竹叶柴胡染色体核型比较分析

比较研究药用植物小叶黑柴胡和窄竹叶柴胡染色体核型。采用常规制片方法结合显微摄影对小叶黑柴胡和窄竹叶柴胡的染色体进行检测分析。结果表明,小叶黑柴胡与窄竹叶柴胡的染色体数目相同,均为2 n=12,核型均为1B型。小叶黑柴胡核型公式是K (2n)=2X=12=5 m+1 sm,核型不对称系数(AS.K%)为56.79%;窄竹叶柴胡核型公式是K(2n)=2 X=12=6 m,核型不对称系数(AS.K%)为54.66%。说明小叶黑柴胡与窄竹叶柴胡染色体核型分析为2种药用柴胡的细胞学研究提供了数据。

藏柴胡与北柴胡急性毒性、解热、抗炎作用的对比研究

目的比较不同产地(甘肃、万荣)的藏柴胡与北柴胡(万荣)栽培品的急性毒性、解热、抗炎作用的差异。方法采用经典急性毒性实验法进行藏柴胡与北柴胡不同提取物的急性毒性比较研究;采用2,4—二硝基苯酚致热大鼠模型比较藏柴胡与北柴胡水煎液的解热作用;采用二甲苯制备耳廓肿胀模型,比较藏柴胡与北柴胡水煎液的抗炎作用。结果甘肃产地藏柴胡与北柴胡比较毒性、解热、抗炎作用较强;万荣产地藏柴胡与北柴胡比较毒性、解热、抗炎作用差异不大。结论万荣产地藏柴胡作为柴胡使用的可能性较大,甘肃产地藏柴胡能否作为柴胡使用仍有待研究。

醋制藏柴胡对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

目的以醋制北柴胡(栽培)水煎液为参照,比较不同产地(甘肃、万荣)的醋制藏柴胡(栽培)水煎液对四氯化碳(CCl4)致急性肝损伤的保护作用。方法昆明种小鼠随机分为正常对照组,模型组,联苯双酯组(7 mg·kg^-1),甘肃藏柴胡、万荣藏柴胡、北柴胡低、高剂量组(5、10 g·kg^-1)。采用腹腔注射CCl4诱导小鼠急性肝损伤,预防给药7 d,测定各实验组小鼠血清中AST和ALT的活性;并检测肝组织中SOD和MDA的水平;计算肝脏指数并观察肝组织病理学变化。结果万荣醋制藏柴胡能够显著降低急性肝损伤模型小鼠肝脏指数和血清AST、ALT水平,使肝组织中MDA含量下降,SOD活性升高,减轻CCl4对肝脏的病理损伤,与北柴胡保肝作用比较差异无统计学意义。甘肃醋制藏柴胡作用不明显。结论万荣醋制藏柴胡对CCl4致小鼠急性肝损伤有保护作用,其机制可能与抗脂质过氧化有关,而甘肃醋制藏柴胡保肝作用不明显,这可能与其皂苷含量成分较高有关。

藏柴胡以及种植北柴胡和竹叶柴胡的皂苷含量研究

目的及方法:分别采用紫外分光光度法和HPLC法测定了藏柴胡(来源于窄竹叶柴胡Bupleurum marginatum var.stenophyllum)及种植北柴胡(B.chinese)和竹叶柴胡(B.marginatum)中柴胡总皂苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。结果:总皂苷含量藏柴胡为2.93%~5.86%,北柴胡为1.56%~2.25%,竹叶柴胡为1.83%~2.50%;柴胡皂苷a+d含量藏柴胡为2.03%~3.95%,北柴胡为0.46%~1.28%,竹叶柴胡为0.88%~1.90%。结论:藏柴胡种植量正以甘肃为中心不断扩大,其中柴胡皂苷含量显著高于其他柴胡,将产生不同的临床效果,应引起充分重视。

基于ITS序列位点特异性PCR鉴别北柴胡掺伪藏柴胡

目的基于ITS序列建立北柴胡掺伪藏柴胡的分子鉴别方法。方法收集北柴胡、藏柴胡样品,提取基因组DNA,用ITS通用引物进行测序,通过DNAMAN软件进行序列比对,根据藏柴胡特异性位点用Primer Premier 5.0软件设计特异性鉴别引物,并优化特异性PCR反应条件。结果在位点特异性PCR反应条件考查中,退火温度为65℃(20 s)、引物量为0.4μL、循环次数为30时特异性最佳,该方法适用于不同DNA聚合酶且重现性较好,掺伪检出限为1%。结论该研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中,仅藏柴胡可以扩增出425 bp大小的条带,北柴胡则不能扩增出条带,能够鉴别北柴胡中掺伪藏柴胡。

柴胡属饮片中藏柴胡掺伪检测方法研究

目的以Nepasaikosaponin K为指标,建立柴胡属饮片中藏柴胡掺伪检测方法。方法采用高效液相色谱-串联质谱技术(HPLC-MS/MS),电喷雾负离子多反应监测模式,以m/z 943.6→635.5、m/z 943.6→797.4、m/z 943.6→781.5为特征离子对,对北柴胡、南柴胡、锥叶柴胡、竹叶柴胡和藏柴胡等5种常见柴胡属饮片中Nepasaikosaponin K含量进行检测。进一步考察Nepasaikosaponin K定量离子对峰面积与藏柴胡掺伪比例之间线性关系,建立柴胡属饮片中藏柴胡掺伪比例计算公式,并以Nepasaikosaponin K为指标,开展藏柴胡掺伪限度研究。结果Nepasaikosaponin K在藏柴胡中含量约为其他种柴胡的25~140倍。藏柴胡掺伪比例为0~100%范围内的混合样品中,定量离子对m/z 943.6→635.5峰面积与掺伪比例之间的线性关系良好。不同柴胡属掺伪模拟样品的计算掺伪量与实际掺伪量偏差在0.6%~1.4%之间。3批市售疑似掺伪北柴胡饮片中藏柴胡掺伪比例分别为14%、16%和27%。结论该分析方法专属性强,灵敏度高,测定结果准确,为柴胡饮片中藏柴胡的掺伪情况筛查与评价提供依据,同时为其他中药饮片的掺伪情况分析提供新的思路与方法。

UPLC-MS/MS检测全粉投料中成药制剂中柴胡掺杂藏柴胡成分方法的研究

目的:以藏柴胡特征成分尼泊尔柴胡皂苷k为指标,建立超高效液相色谱-质谱法检测全粉投料中成药制剂中柴胡掺伪藏柴胡成分。方法:采用Agilent Eclipse Plus C18(100 mm×3 mm, 1.8μm)色谱柱,以水(A)-乙腈(B)为流动相,二元梯度洗脱(0~3 min, 75%A→70%A;3~12 min, 70%A→68%A;12~12.5 min, 68%A→10%A;12.5~15.5 min, 10%A),流速0.3 mL·min^(-1),柱温40℃,进样量1μL。采用电喷雾负离子化,多反应监测(MRM)模式,选择m/z 943.5→797.5、943.5→781.5和943.5→635.4为检测离子对。结果:尼泊尔柴胡皂苷k质量浓度在0.05~5μg·mL^(-1)范围与峰面积呈现出良好的线性关系(r=0.996 5),仪器精密度RSD(n=6)为1.4%,掺伪10%藏柴胡参比溶液重复性RSD(n=6)为1.8%,掺伪检测限为1%。对代表性品种逍遥丸、加味逍遥丸、补中益气丸、龙胆泻肝丸进行筛查,结果9批逍遥丸中有2批,8批加味逍遥丸中有4批,10批补中益气丸中有1批,10批龙胆泻肝丸中有2批含尼泊尔柴胡皂苷k超过拟定限度。结论:本方法经过方法学验证,专属性强,灵敏度高,可应用于全粉投料中成药制剂中柴胡掺杂藏柴胡成分的检查。

藏柴胡中三萜皂苷类成分的研究

该研究主要探究藏柴胡中的三萜皂苷类成分。采用大孔吸附树脂,MCI,硅胶,ODS,MDS柱色谱以及半制备高效液相色谱等分离纯化方法,从藏柴胡70%乙醇（含0.5%氨水）提取物中得到12个化合物。利用高分辨质谱、核磁共振等波谱手段鉴定其结构分别为柴胡皂苷b2（1）,柴胡皂苷a（2）,柴胡皂苷b1（3）,柴胡皂苷d（4）,hydroxysaikosaponin a（5）,柴胡皂苷b3（6）,柴胡皂苷c（7）,柴胡皂苷i（8）,柴胡皂苷f（9）,chikusaikosidesⅡ（10）,柴胡皂苷s（11）,柴胡皂苷I（12）。12个化合物均属齐墩果烷型三萜皂苷类化合物,其中化合物1,3,5,8~9,11~12均为首次从该植物中分离得到。体外抗流感病毒实验表明在20μmol·L-1下,化合物2,4,6,8,11~12对流感病毒WSN33具有较明显抑制作用,其抑制率分别为91.3%,88.6%,53.4%,61.3%,77.3%,57.4%。

基于ITS2条形码鉴定藏柴胡及其易混品

目的采用DNA条形码分子鉴定技术鉴定藏柴胡(又名窄竹叶柴胡)Bupleurum marginatum及其易混品,以确保柴胡药材质量及临床用药安全。方法收集柴胡药材共50份,对其ITS2序列进行PCR扩增并双向测序,所得序列用Codon Code Aligner软件校对拼接后,利用MEGA 6.0对序列进行分析比对,计算种内、种间遗传距离,利用邻接法(NJ)构建系统聚类树,并应用ITS2数据库网站预测其ITS2二级结构。结果藏柴胡种内遗传距离明显小于它与其同属的种间遗传距离,基于ITS2建立的NJ树和网站预测的ITS2二级结构,均能准确将藏柴胡药材与其易混药材区分。结论基于ITS2序列可以科学准确地鉴别藏柴胡药材及其易混品,为确保临床用药安全提供更多先进可靠的技术手段。

基于顶空-气相色谱-离子迁移谱的北柴胡与藏柴胡鉴别

【目的】建立北柴胡与藏柴胡的顶空-气相色谱-离子迁移谱(HS-GC-IMS)的挥发性指纹图谱,用以快速鉴别北柴胡与藏柴胡。【方法】使用键合交联聚乙二醇柱(MXT-WAX)和5%苯基-甲基聚硅氧烷柱(MXT-5)分别检测21批北柴胡和17批藏柴胡的挥发性指纹谱。分析北柴胡与藏柴胡的特征峰,并对特征峰进行主成分分析,以鉴别北柴胡与藏柴胡。【结果】利用MXT-5色谱柱检测获得北柴胡挥发性特征峰1个,藏柴胡挥发性特征峰5个,主成分1(PC-1)与主成分2(PC-2)总占比为87%;利用MXT-WAX色谱柱检测获得北柴胡挥发性特征峰4个,藏柴胡挥发性特征峰4个,主成分分析PC-1与PC-2总占比为91%。【结论】应用HS-GC-IMS并选用MXT-WAX色谱柱可简单、快速、更好地区分北柴胡与藏柴胡。