MEBT/MEBO对慢性难愈合创面组织中CK10表达水平的影响

目的通过对比观察不同治疗方案对大鼠创面组织内CK10表达水平的影响,进一步揭示皮肤再生医疗技术(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment, MEBT/MEBO)治疗慢性难愈合创面的部分作用机制。方法将90只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组(18只)、急创组(18只)、慢创组(18只)、rb-bFGF组(18只)及MEBO组(18只),其中空白组大鼠仅做备皮处理,急创组大鼠建立急性创面模型,慢创组、 rb-bFGF组及MEBO组大鼠建立慢性难愈合创面模型,且空白组大鼠局部皮肤予以生理盐水纱布湿敷,急创组及慢创组大鼠创面予以生理盐水治疗, rb-bFGF组大鼠创面予以重组牛碱性成纤维细胞生长因子(recombinant bovine basic fibroblast growth factor, rb-bFGF)凝胶治疗, MEBO组大鼠创面予以湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment, MEBO)治疗,分别于治疗第3、 7、 14天对比观察5组大鼠皮肤或创面组织的形态学变化及CK10的表达水平。结果 (1)治疗第3天,空白组大鼠皮肤组织形态与正常皮肤组织形态无明显差异,其他各组大鼠创面组织水肿明显,可见大量炎性细胞浸润及少量成纤维细胞与新生毛细血管分布;治疗第14天,空白组大鼠皮肤组织形态与正常皮肤组织形态无明显差异,慢创组大鼠创面组织内仍有少量炎性细胞浸润,且有大量排列不规则的成纤维细胞分布,而急创组、 rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织内可见排列整齐的新生毛细血管及完整的毛囊和皮脂腺等皮肤附属器,组织结构接近于正常皮肤组织。(2)治疗第3、 7、 14天,空白组大鼠皮肤组织内CK10表达水平无明显变化,P> 0.05,差异无统计学意义;而急创组、慢创组、 rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织内CK10表达水平呈现逐渐升高的趋势,P均<0.05,差异具有统计学意义。(3)治疗第7、 14天,急创组、rb-bFGF组和MEBO组大鼠创面组织内CK10表达水平均明显高于慢创组,P均<0.05,差异具有统计学意义;治疗第3、 7、 14天, rb-bFGF组和MEBO组大鼠创面组织内CK10表达水平均无明显差异,P均> 0.05,差异无统计学意义。结论 MEBT/MEBO治疗慢性难愈合创面的疗效不亚于rb-bFGF凝胶,且改变表皮干细胞的外界生存环境,促进表皮干细胞向正常表皮细胞增殖、分化,可能是其促进慢性难愈合创面修复的作用机制。

The Mechanism of Burn Regenerative Therapy and Wound Healing

Objective: From molecular, cell and systemic clinical treatment three levels, this report revealed the mechanism of wound healing, the basic theory and the importance of clinical practice for the Burn Regenerative Therapy with MEBT/MEBO (BRT & MEBT/MEBO).Method: This report analyzed the importance and clinical curative effect for standardized appliance of BRT & MEBT/MEBO from two key points: 1) Liquefaction of necrotic tissue from burn wound; 2) Skin regeneration in situ . Result: There are three necessary conditions for skin physiologically repair and regeneration of burn wound: 1) The formation of moist physiological environment on burn wound; 2) The material foundation of life regenerative substances and histology for keratin-19 stem cells’ regeneration in situ ; 3) Standardized procedures and appliance of BRT & MEBT/MEBO, which is the guarantee of burn wound healing physiologically. Conclusion: The theory of “Potential Regenerative Cell" and the technique of “Stem cell in situ regeneration" are the basic theory and clinical treatment for BRT. Full-thickness burn skin can be healed physiologically and the skin tissues and organs can be regenerated ONLY by standardized procedures and timely appliance of BRT & MEBT/MEBO.

正常皮肤和瘢痕组织表达β1整合素与系列角蛋白的比较性研究

目的 :研究幼儿与成人大面积重度烧伤后瘢痕组织表皮细胞表达 β1整合素及系列角蛋白的特征与规律 ,以确定表皮干细胞及短暂扩充细胞分布、数量的差异及这些改变与瘢痕愈合关系。方法 :分别取 4～ 10岁幼儿及 35～ 5 1岁成人 2组健康皮肤及大面积深度烧伤后瘢痕组织。采用免疫组织化学方法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和角蛋白 19(K19)及分化表皮细胞表达的角蛋白 14与 10 (K14和 K10 )。结果 :瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与 K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少 ,阳性强度降低 ;瘢痕组织表皮中表达 K14的阳性细胞仅位于表皮底部 2～ 3层 ,明显少于健康皮肤 ;而 K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛。结论 :瘢痕组织表皮基底层具有增殖能力的表皮干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤 ,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同 ,处于有丝分裂后细胞阶段的细胞比例降低 ,而终末分化细胞的比例明显增高。瘢痕组织表皮的增殖能力下降、细胞的分化行为紊乱可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变。

表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布差异

目的 :研究表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布差异。 方法 :从 5例成年男性志愿者身体取头部、胸部、背部、臀部、大腿内侧、大腿外侧、上臂内侧、上臂外侧、手掌、足底、包皮及阴囊皮肤标本 ,采用免疫组织化学 En Vision法检测皮肤组织表皮干细胞标志物角蛋白 19(K19)和整合素 β1 的表达。结果 :皮肤基底层 K19和整合素 β1 阳性细胞以包皮和阴囊最多 ,其次是臀部 ,背部及四肢近端外侧相应地多于胸部及四肢近端内侧 ,头皮、手掌及足底皮肤基底层阳性细胞很少。头皮毛囊隆突部及皮下腺管可见较多 K 19和整合素β1 阳性细胞。结论 :表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布存在差异 ,头皮的毛囊隆突部及包皮和阴囊的皮肤基底层存在较多表皮干细胞 ,背部及四肢近端外侧皮肤基底层表皮干细胞相应地多于胸部及四肢近端内侧。

GFP标记成年大鼠表皮神经嵴干细胞的分离培养与形态学特征

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记大鼠表皮神经嵴干细胞(EPI-NCSC)的分离培养方法,为EPI-NCSC在体移植研究脊髓损伤修复奠定基础。方法分离成年GFP大鼠胡须毛囊,取毛囊隆突部贴附于胶原包被的培养板上。在培养第4天有大量细胞游出,取出贴附的毛囊隆突部,细胞传代培养。细胞采用SOX10和Nestin免疫细胞化学染色鉴定,并计算细胞纯度。结果 EPI-NCSC在胶原基质上从隆突部游出,细胞为圆形或梭形,呈强绿色荧光。免疫细胞化学染色SOX10和Nestin双阳性,纯度在99%以上。结论本实验方法简便易行,能分离出高纯度的GFP-EPI-NCSC,可作为一种有效的工具细胞用于损伤脊髓修复研究。

过表达microRNA-26a大鼠表皮干细胞来源外泌体对深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合的影响

目的 探究过表达microRNA-26a(miR-26a)的大鼠表皮干细胞(EPSC)来源外泌体(Exos)对深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合的影响。方法 体外培养大鼠EPSC,用携带miR-26a-绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒颗粒和阴性对照(NC-GFP)转染以上调miR-26a表达,并从未转染的EPSC、NC-GFP转染的EPSC或miR-26a-GFP转染的EPSC中分离Exos,透射电子显微镜(TEM)和纳米粒子追踪分析(NTA)观察Exos形态和大小,蛋白质印迹(Western blot)检测Exos表面标志物CD9、CD63和CD81的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测EPSC及EPSC-Exos中miR-26a表达,CCK-8法检测EPSC的增殖活性;小管形成实验评估miR-26a-EPSC-Exos对血管生成的影响。建立大鼠深Ⅱ度烧伤模型,分为对照组(control组)、NC-EPSC-Exos组和miR-26a-EPSC-Exos组,每组30只。NC-EPSC-Exos组和miR-26a-EPSC-Exos组大鼠给予相应的Exos干预,control组大鼠给予等体积的PBS,每周1次,持续3周。分别在烧伤后第7、14和21天,观察各组大鼠烧伤创面状况,计算创面愈合率;HE染色观察创面组织病理学变化,并进行组织学评分;免疫组织化学法检测创面CD31阳性表达,计算微血管密度(MVD)。结果 miR-26a转染可显著升高EPSC及其Exos中miR-26a表达,促进EPSC细胞增殖(P<0.05);TEM和NTA分析结果显示,Exos呈球形,直径范围在40~150 nm, CD9、CD63和CD81均呈阳性;小管形成实验结果显示,miR-26a-EPSC-Exos可显著增加管长度,促进内皮细胞血管生成(P<0.05)。体内动物实验结果显示,miR-26a-EPSC-Exos可显著加速深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合和修复,增加组织学评分和MVD(P<0.05)。结论 过表达miR-26a的EPSC-Exos可促进深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合。

SD大鼠羊水间充质干细胞向神经样细胞体外诱导分化

目的:探讨体外诱导羊水间充质干细胞(AF-MSCs)分化成神经干细胞.方法:10只SD怀孕大鼠,180-240g,胎龄16d,过量腹腔麻醉致死,开腹全部切除子宫,在无菌的条件下抽取全羊水,采用贴壁法分离AF-MSCs,体外培养扩增,观察细胞生长特性,流式细胞仪检测AF-MSCs表面抗原表达及细胞周期.取第3代AF-MSCs,加入预诱导液(DMEM/F12、100mL/LFBS、1mmol/Lβ-MEM)诱导24h,然后加入诱导液(DMEM/F12、100mL/LFBS、5mmol/Lβ-MEM)诱导24h,最后在分化维持培养液(DMEM/F12、20μg/LEGF、20μg/L bFGF)中培养,行免疫荧光染色,检测NSE和GFAP的表达.结果:成功分离、培养和传代SD大鼠AF-MSCs,流式细胞术检测提示大鼠AF-MSCs的G0/G1期细胞比例约为87.5%、S+G2+M期比例为12.5%,表达CD44为98.3%、CD29为70%、和CD105为33.2%、不表达CD45为0.5%,CD34为1%,DLA-DR(MHCclassⅡ)为0.1%.诱导后,AF-MSCs能表达神经细胞标示物NSE和GFAP,且可在体外继续存活2wk左右.结论:羊水中也存在MSCs,与其他来源的MSCs特点相符;羊水可以作为一种新的胎儿MSCs来源,而且能在体外诱导分化为神经细胞.

烧伤湿性医疗技术对表皮再生干细胞作用的研究

目的 :探索烧伤湿性医疗技术于浅Ⅲ度烧伤时脂肪层烧伤创面自然修复的机制。方法 :应用细胞免疫化学方法生物素 抗生物素蛋白 (biotinavidin)DCS体系间接免疫荧光技术。以小鼠抗人角蛋白 1 9的单克隆抗体检测表皮再生干细胞。结果 :烧伤后2 4h可见表皮再生干细胞出现。烧伤后 4天表皮再生干细胞数量增多。烧伤后 7天和 1 4天表皮再生干细胞数量最多。烧伤后 2 1天和 2 8天表皮再生干细胞减少。结论

成体干细胞原位再生修复深度烧伤创面的研究——在第十九届夏威夷国际烧伤会议上的报告

目的 :利用深度烧伤创面的残存皮下组织细胞的皮肤干细胞再生潜能进行培植 ,实现皮肤全层功能器官的原位全部再生。方法 :以成人深度烧伤为研究对象 ,以人体原位角蛋白 1 9型表皮干细胞作为皮肤干细胞标志 ,以人体原位未传代的组织切片连续跟踪皮肤全层原位再生复制全过程。结果 :1、烧伤后残存的皮下组织细胞可转化为皮肤干细胞 ;2、原位成体干细胞可再生复制全层皮肤器官 ;3、成体干细胞再生复制皮肤全层器官是同由人体再生潜能和人为调控共同完成 ;4、成体干细胞再生复制皮肤全层器官已成功用于特大面积、特重烧伤的临床治疗。结论 :利用成体干细胞原位再生复制修复创面是从临床实践获得的成果 ,为人类提供了保障健康长寿的生命技术、方法和物质 ,使人们从对干细胞的研究从单细胞生命活动的探索阶段 ,直接跨入了生命体实际应用阶段 ,开辟了再生医学的新领域。

深Ⅱ度烧伤的瘢痕防治与护理措施

目的 :探索深Ⅱ度烧伤瘢痕防治护理措施。方法 :针对MEBT/MEBO治疗深Ⅱ度烧伤与汗腺再生表皮干细胞修复中存在的问题采用相应的护理措施 ,并对 14 1例病人作为护理观察对象。结果 :全部病人经创面康复护理 ,功能锻炼 ,心理护理等均达到无瘢痕愈合与身心健康。结论

正常皮肤和瘢痕组织表达β1整和素与系列角蛋白特征的比较性研究

目的:采用特殊染色法研究幼儿与成人大面积重度烧伤后瘢痕组织表皮细胞表达β1整和素和角蛋白19、14以及10的特征与规律,并在此基础上确定表皮干细胞及短暂扩充细胞分布、数量的差异以及这些改变与瘢痕愈合关系。方法:分别取幼儿及成人健康皮肤与大面积深度烧伤后瘢痕组织。采用免疫组化方法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达β1整和素和角蛋白19(K19)以及分化表皮细胞表达的角蛋白14与10(K14、K10)。结果:瘢痕组织表皮基底层表达β1整和素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低。瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛。结论:实验结果提示,瘢痕组织表皮基底层具有增殖能力的表皮干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后细胞阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高。提示瘢痕组织表皮的增殖能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一。

皮肤组织工程种子细胞-表皮干细胞提供来源选择的研究

目的寻找表皮基底层细胞中含有较高干细胞比例的供皮区。方法选择不同供皮部位，利用免疫组织化学的方法，以K19和整合素β1作为表皮干细胞鉴定标记。结果皮肤基底层表皮干细胞以包皮及阴囊最多，其次是臀部，背部多于胸部。四肢近端外侧多于四肢近端内侧，头皮、手掌及足底皮肤基底层干细胞数量较少。结论从组织工程种子细胞的供应来源考虑，以男性包皮最佳，在客观上也容易获得。

应用烧伤湿性医疗技术预防和治疗烧伤残创的研究(附105例报告)

目的 比较烧伤湿性医疗技术 (MEBT/MEBO)和传统疗法对烧伤残余创面的治愈时间。方法 将 1991年 4月采用烧伤湿性医疗技术至 2 0 0 2年 4月治疗烧伤余创面 10 5例的治愈时间与同期收集的 10 0例用传统疗法治疗的烧伤残余创面治愈时间对照比较。结果 烧伤性湿性医疗技术 (MEBT/MEBO)组由于干细胞参与了烧伤残余创面的修复和全层皮肤再生的全过程 ,因此创面愈合时间平均 15天 ,且愈合后几乎无瘢痕 ,无功能障碍 ;对照组平均愈合时间 32天 ,愈后瘢痕明显 ,多有功能障碍。

重组人表皮生长因子对深Ⅱ度烧伤大鼠创面角蛋白19阳性表达的影响

目的研究重组人表皮生长因子(rh EGF)对深Ⅱ度烧伤大鼠创面角蛋白19(K19)阳性表达的影响。方法健康SD大鼠70只,随机分为研究组与对照组,每组35只。制备烧伤模型采用水蒸气烫伤法,病理切片提示均为深Ⅱ度烧伤。造模2 h后研究组应用rh EGF凝胶,对照组应用磺胺嘧啶银乳膏,均治疗28 d。面积计算法观察对比两组不同时点创面愈合率,免疫组化法观察对比两组不同时点创面组织K19阳性细胞率,比较两组不同时点创面成纤维细胞数量。结果研究组大鼠第4、7、11、15天创面愈合率明显高于对照组(P<0.05)。研究组大鼠第1、15、21、28天创面组织K19阳性细胞率与对照组比较,差异无显著性(P>0.05),第4、7、11天研究组大鼠创面组织K19阳性细胞率显著高于对照组,差异具有显著性(P<0.05)。研究组大鼠第21天创面成纤维细胞数量与对照组比较,差异无显著性(P>0.05),研究组大鼠第7、14天创面成纤维细胞数量明显高于对照组(P<0.05)。结论大鼠实验结果提示,rh EGF通过促进k19阳性表达,增强创面表皮干细胞的增殖分化,从而加速深Ⅱ度烧伤创面愈合,具有显著性效果,值得临床推广。

脂肪来源干细胞基质胶联合重组人表皮细胞生长因子治疗深Ⅱ度烧伤患者的效果

目的:观察脂肪来源干细胞基质胶(SVF-gel)联合重组人表皮细胞生长因子(rhEGF)治疗深Ⅱ度烧伤患者的效果。方法:选取78例深Ⅱ度烧伤患者为研究对象,采用随机数字表法分为对照组(39例,创面110个)和观察组(39例,创面106个)。对照组采用rhEGF治疗,观察组在对照组基础上联合SVF-gel治疗,比较两组治疗前后视觉模拟评分法(VAS)评分,治疗7、14 d后创面愈合率,创面完全愈合时间和不良反应发生率。结果:观察组治疗7、14 d后VAS评分均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组治疗7、14 d后创面愈合率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组创面完全愈合时间短于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组均未发生明显不良反应。结论:SVF-gel联合rhEGF治疗深Ⅱ度烧伤患者可减轻患者疼痛,提高创面愈合率,缩短创面完全愈合时间,效果优于单纯rhEGF治疗。

体外培养表皮干细胞复合高分子支架原位修复深度烧伤创面的研究

目的探讨表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架体内培养,对Ⅲ度烧伤创面的修复和再生作用。方法 (1)表皮干细胞的培养和表征:采用快速贴壁法分离和培养表皮干细胞(Epidermal Stem Cell,ESC)。将表皮干细胞分别在经Ⅳ型胶原蛋白修饰的和未经修饰的培养瓶中,或通过悬浮法培养,研究表皮干细胞的生长特性;以βl整合素和细胞角蛋白CK19免疫荧光染色实验考察细胞表型。(2)活性支架的体外构建和对大鼠Ⅲ度创面的修复作用研究:体外构建成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架;采取同体对照法,在20只Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)背部制作两个Ⅲ度切痂创面。左侧创面采用体外培养的自体表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架移植入创面,作为组织工程移植物组;右侧创面采用凡士林纱布敷料覆盖,作为凡士林纱布敷料组。考察组织工程移植物对大鼠Ⅲ度创面的愈合作用。结果以快速贴壁法能够有效地分离得到表皮干细胞,细胞在经Ⅳ型胶原蛋白修饰的培养瓶中生长10d后融合,数目达到5.1×105/cm2。免疫荧光实验表明细胞表面抗原呈βl整合素和角蛋白免疫CK19成阳性,证明分离得到的细胞为表皮干细胞。成纤维细胞能够在丝素蛋白纳米纤维中扩增并分泌细胞外基质,14d后与丝素蛋白纳米纤维形成活性支架。对大鼠Ⅲ度烧伤创面的修复实验表明,组织工程移植物组的创面在第14天和第22天的平均愈合效率为66%和93%,高于凡士林纱布敷料组(32%和69%),P<0.05。组织工程移植物组的创面平均愈合天数为21d,低于凡士林纱布敷料组(31d),P<0.05。结论通过Ⅳ型胶原蛋白黏附法,能够分离得到表皮干细胞,并且其在Ⅳ型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中的生长活力较高。大鼠Ⅲ度创面的修复实验表明,组织工程移植物,即表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维支架,能够修复Ⅲ度创面,再生皮肤表真皮结构完整;并且与凡士林纱布敷料相比,能够提高创面的愈合效率,减少创面的愈合时间。

荷负电气溶胶治疗大鼠烧伤创面后表皮干细胞的变化

目的探讨荷负电气溶胶对烧伤创面表皮干细胞影响以及其促进创面愈合的机制。方法将清洁级健康Wistar大鼠48只随机分为A、B两组,每个动物背部两侧分别制成实验创面或对照创面,实验创面以荷负电气溶胶照射,A组动物每日照射2次,B组每日照射1次;利用干细胞表达β1整合素的特性,加入整合素β1抗体,通过免疫组织化学染色检测创面表皮干细胞含量的变化,比较各时相点两组创面间的差异。结果 A、B两组各时相点实验创面的表皮干细胞数目是同组对照创面的1．5到2倍;而A组实验创面的表皮干细胞数又较B组实验创面增多。结论经用荷负电气溶胶照射大鼠烧伤创面能促进表皮干细胞的增殖。

P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤及体外细胞创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响

目的观察P311在小鼠浅Ⅱ发烧伤技体外细胞创伤模型中对表皮干细胞（ESC）辽移的作用并探讨其机制。方法（1）取18只C57BL／6小鼠，其中15只行背部浅Ⅱ度烧伤，于伤后6、12、24、48、72h取创面及创周皮肤组织，各时相点3只；余下3只小鼠作为正常对照，同法取止常皮肤标本。采用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶（SP）染色法观察P311在上述皮肤组织中的表达。（2）取6只新生的C57BL／6小鼠，连续3d腹腔注射50μg／g溴脱氧尿苷（BrdU，2次／（1）建立ESC示踪模型。7周后于其背部制作浅Ⅱ度烧伤创面。伤后72h取创面皮肤组织制作连续切片，SP法免疫组织化学染色，观察P311阳性和BrdU阳性细胞空间共定位情况。（3）构建腺病毒空载体pAdEasy-增强型绿色荧光蛋h（EGFP）及P311腺病毒表达载体pAdEasy-EGFP-P311，并进行包装。应用Ⅳ型胶原快速黏附法分离培养人ESC,按照随机数字表法将其分为P311高表达组和EGFP对照组，每组3孔，分别以pAdEasy-EGFP-P311及pAdEasy-EGFP腺病毒感染ESC。2组ESC经丝裂毒素C处理2h后行划痕实验。划痕后0（即刻）、24、48、72h测量地固定范围内划痕剩余面积，计算划痕愈合面积百分比。对数据进行独立样本t检验。结果（1）浅Ⅱ度烧伤后不同时相点，P311在创面不同部位的表达量各不相同。伤后创面毛囊、新生表皮巾P311表达量随时间延长逐渐上升；创用表皮及毛囊的P311表达量于伤后12h达高峰，72h回落至正常。（2）应用BrdU标记的小鼠浅Ⅱ度烧伤创Ⅲ新生表皮层可见P311阳性细胞和BrdU阳性细胞共定位。（3）划痕后48、72h，P311高表达组ESC划痕愈合面积百分比分别为（69±31）％、（89±26）％，明显高于EGFP刘照组[（35±12）％、（46±31）％，t值分别为-2．336、-2，611，P值均小于0．05]。结论P311可明显促进小鼠浅Ⅱ度烧伤创面及体外细胞创伤模型中的ESC迁移，可能在创面修复中起重要作用。

角蛋白19在Ⅲ度烧伤创面修复过程中的表达及意义

目的 通过对Ⅲ度烧伤创面原位再生修复过程中不同活组织角蛋白 19(K19)表达特征的研究 ,探索Ⅲ度烧伤创面原位再生修复的可能机制。方法 选择有Ⅲ度烧伤创面的青年患者 10例 ,在原位再生修复过程中的不同时期分别切取活组织 ,应用过氧化酶标记的链霉卵白素 (SP)免疫组化法 ,以K19单抗检测表皮干细胞的分布和形态特征 ;同时取供皮区的正常皮肤以及慢性溃疡组织作对照。结果 ⑴正常皮肤组织只有表皮基底细胞层和附属器的部分细胞表达K19;⑵伤后 3～ 6d ,10例患者的痂下活组织均未发现K19表达阳性细胞 ;⑶肉芽样组织有部分细胞表达K19;⑷早期再生组织检测结果示 :在再生表皮的中部 ,即位于基底膜与颗粒层之间有大量的K19表达阳性细胞 ,且分布广泛而有规律 ;⑸晚期再生组织检测结果显示 :与正常皮肤类似 ;⑹入院前慢性皮肤溃疡组织中无K19表达阳性细胞。结论 Ⅲ度烧伤创面经烧伤湿性医疗技术加rhEGF治疗后K19表达阳性细胞可以从无到有产生并不断增加 。

经外源性血管内皮生长因子处理的大鼠表皮干细胞对深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合的影响及机制

目的探讨经外源性血管内皮生长因子(VEGF)处理的大鼠表皮干细胞(ESC)对深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合的影响及机制。方法从1只3个月龄雌性SD大鼠躯干皮肤分离获得ESC,取第3代对数生长期细胞进行实验(1)^(3)。(1)取细胞,采用角质形成细胞专用无血清培养基(K-SFM)常规培养(常规培养条件下同),于倒置光学显微镜下观察培养3、5 d细胞形态。(2)取细胞常规培养24 h,流式细胞仪检测细胞表面标志物CD44、CD45、CD11b和CD11c的表达,样本数为3。(3)取4个批次细胞,各批次细胞均采用随机数字表法分为空白对照组和VEGF组。空白对照组细胞常规培养,VEGF组细胞用含终质量浓度为10 ng/mL VEGF的K-SFM培养。1个批次细胞培养10 d,采用蛋白质印迹法检测细胞角蛋白19(CK19)、CK10蛋白表达;1个批次细胞培养0(即刻)、2、4、6、8、10 d,分别取细胞采用实时荧光定量反转录PCR法检测Nanog mRNA表达;1个批次细胞培养2、4、6、8、10 d,分别取细胞采用细胞计数试剂盒8测定吸光度值;1个批次细胞培养10 d,光学显微镜下观察计数>50个细胞的克隆数,计算细胞克隆形成率。各批次细胞各时间点样本数均为3。(4)选取36只3个月龄雌雄不限SD大鼠,用100℃铁质圆片在每只大鼠背部两侧压迫10 s制作2个直径为10 mm的深Ⅱ度烫伤(下称烧伤)创面。按随机数字表法将致伤大鼠分为VEGF+ESC组、单纯ESC组及空白对照组,每组12只大鼠、24个创面。伤后0(即刻)~2 d,3组大鼠每个创面均每天一次性注射20μL磷酸盐缓冲液(PBS),其中VEGF+ESC组PBS中含0.8×10^6个/mL经10 ng/mL VEGF处理10 d的ESC、单纯ESC组PBS中含0.8×10^6个/mL未经任何处理的ESC、空白对照组PBS中不含任何其他物质。于首次注射后(下称注射)0(即刻)、3、7、14 d,先按随机数字表法于每组分别取3只大鼠观察并记录创面愈合情况,计算注射3、7、14 d创面愈合率;随后处死各时间点大鼠切取创面组织行苏木精-伊红染色,行组织学观察。对数据行独立样本t检验、析因设计方差分析、LSD检验、Bonferroni校正。结果(1)培养3 d细胞呈集群分布,细胞集群生长缓慢;培养5 d集群大而圆,集群内细胞主要为细胞核大而圆、胞质少的细胞,符合ESC形态特征。(2)细胞表面CD44阳性表达率为(94.3±1.2)%,CD45、CD11b、CD11c呈阴性表达。细胞鉴定为ESC。(3)培养10 d,与空白对照组比较,VEGF组细胞CK19蛋白表达水平明显升高(t=3.756,P<0.05),CK10蛋白表达水平显著降低(t=3.149,P<0.05)。与空白对照组比较,VEGF组细胞培养0、2 d Nanog mRNA表达量和培养2、4 d吸光度值无明显变化(t=0.58、0.77,0.53、3.02,P>0.05),培养4、6、8、10 d Nanog mRNA表达量和培养6、8、10 d吸光度值均明显升高(t=6.34、5.00、5.58、4.61,5.65、10.78、15.51,P<0.01)。培养10 d,VEGF组细胞克隆形成率为(56.4±1.3)%,显著高于空白对照组的(31.5±1.3)%(t=13.96,P<0.01)。(4)注射0 d,3组大鼠创面均可见深度达真皮浅层的烧伤创面。注射3 d,VEGF+ESC组大鼠创缘正常皮肤组织轻微收缩,早于其余2组;注射7 d,VEGF+ESC组大鼠新生表皮已覆盖大部分创面,单纯ESC组大鼠创周可见部分上皮爬行,空白对照组大鼠创面未见明显上皮化现象;注射14 d,VEGF+ESC组大鼠创面基本愈合,单纯ESC组大鼠尚余少部分创面未愈合,空白对照组大鼠尚余大部分创面未愈合。3组大鼠注射3 d创面愈合率相近(P>0.05);单纯ESC组大鼠注射7、14 d创面愈合率分别为(26.0±2.0)%、(64.4±4.7)%,明显高于空白对照组的(12.4±1.1)%、(29.1±3.3)%(P<0.01),2组均明显低于VEGF+ESC组的(41.0±2.4)%、(91.3±3.5)%(P<0.01)。注射3 d,VEGF+ESC组大鼠创面可见大量炎性细胞浸润,早于其余2组;注射7 d,VEGF+ESC组大鼠创面可见大量内皮细胞,单纯ESC组大鼠创面可见部分内皮细胞增殖,空白对照组大鼠创面可见大量炎性细胞浸润;注射14 d,VEGF+ESC组大鼠创面新生表皮细胞基本覆盖创面,单纯ESC组大鼠创面新生表皮细胞覆盖大部分创面,空白对照组大鼠创面基底可见大量内皮细胞且新生表皮细胞覆盖部分创面。结论经外源性VEGF处理的大鼠ESC可促进深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合,这可能与VEGF促进ESC增殖并降低其分化水平从而维持细胞干性有关。