Duplex PCR快速检测松材线虫

利用duplexPCR技术对松材线虫 (Bursaphelenchusxylophilus)与拟松材线虫 (B .mu cronatus)的rDNA部分核苷酸序列扩增。根据松材线虫与拟松材线虫的ITS1序列区别 ,设计出特异性引物 ,检测松材线虫的存在 ;在 5 8S ,2 8S保守序列区设计通用引物 。

松材线虫rDNA的测序和 PCR-SSCP分析

本文为克服形态鉴定的不足 ,用分子生物学的方法鉴别松材线虫。线虫核糖体 DNA(r DNA)的内部转录间隔区 (ITS1)区 (约 30 8bp)的测序结果显示 :松材线虫种内区别很小 ,不超过 1bp;拟松材线虫种内区别较大 ,最大达 7bp;这 2种线虫的种间区别为 32～ 39bp。根据以上测序结果 ,本文结合单条线虫 DNA的提取技术 ,对 14个松材线虫和拟松材线虫样本进行了单链构象多态性 (PCR-SSCP)分析 ,结果表明 PCR- SSCP分析技术可明确区分这 2种线虫 ,该技术可为单条松材线虫的鉴定提供一套灵敏而可靠的方法。

松材线虫和拟松材线虫的PCR快速检测

利用PCR技术对松材线虫Bursaphelenchusxylophilus与拟松材线虫B .mucronatus的rDNA的ITS1区和5 8S区核甘酸序列扩增.根据松材线虫与拟松材线虫的ITS1序列区别,分别设计出松材线虫和拟松材线虫的特异性引物,实现了单条活的或FG(φ为4 %的甲醛)固定的松材线虫和拟松材线虫的快速检测.

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR-RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA-ITS区片段长度约为890 bp,拟松材线虫rDNA-ITS区片段长度约为930 bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切,结果表明:(1)DraI酶切松材线虫群体均产生两个长度约510 bp和380 bp的片段,而拟松材线虫均不能被DraI酶切;(2)所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaI酶切;(3)用MspI酶切松材线虫群体,除GZ02不能够被酶切外,其余样本能够产生两条长度分别为530 bp和360 bp的谱带。拟松材线虫群体,都能产生3条一致的亮带,长度分别为340 bp2、90 bp、180 bp;(4)所有松材线虫样本均不能被SalI酶切,而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720 bp和220 bp的片段;(5)XhoI酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520 bp和370 bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530 bp和400 bp的谱带。因此,内切酶DraI、SalI可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspI、ApaI、XhoI不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。

松材线虫PCR快速检测方法研究

松材线虫是许多国家的检疫性有害生物 ,其形态与拟松材线虫非常相似。为克服传统的形态学鉴定的不足 ,本研究依据松材线虫rDNA基因部分序列 ,通过单个碱基的故意错配 ,设计了一对特异性引物 ,运用PCR方法 ,最终实现了对单条松材线虫的快速检测。

松墨天牛携带的松材线虫PCR检测技术(英文)

利用本研究筛选出的一对松材线虫特异性PCR引物(上游引物:5′-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3′,下游引物:5′-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3′),从松材线虫DNA中,扩增出一条长度403bp(基因库登陆号:DQ855275)的特异性DNA片段。该引物可以将松材线虫DNA与松墨天牛组织以及拟松材线虫、畸刺伞滑刃线虫、变异伞滑刃线虫、小角伞滑刃线虫、利昂伞滑刃线虫、湖南伞滑刃线虫、红松滑刃线虫、滑刃属线虫、斯坦纳长尾线虫、小茎线虫、剑尾齿杆双胃线虫和寄生小杆属线虫等12种线虫的DNA区分开来。在此基础上,建立一套利用PCR技术直接从受感染的松墨天牛组织中检测出松材线虫的技术,并在实际运用中得到检验。

松材线虫RAPD-PCR反应体系的优化与分子鉴定标记的筛选

应用随机引物S344、S356和S360比较分析了PCR热循环复性温度、Mg^2＋浓度和模板浓度对松材线虫基因组DNA的RAPD扩增结果的影响，旨在建立松材线虫的最佳反应体系，并以此进行松材线虫的分子鉴定标记筛选。结果表明：37℃的复性温度、3．0mmol·L^-1Mg^2＋、10μL反应体系中松材线虫基因组DNA模板1～25ng是研究松材线虫RAPD特征的最佳反应体系。利用此反应体系，通过对100个随机引物的分析，获得了3条松材线虫区别于拟松材线虫的分子鉴定标记。

利用荧光PCR快速检测松材线虫

利用荧光PCR从美国进境的木质包装材料中成功检出松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus).结果表明,探针检测松材线虫样品时,可产生明显的荧光信号,但空白水对照、小杆线虫(Rhabditida)、拟松材线虫(B.mucronatus)无荧光信号,表明探针有较强的特异性,且具有简单、灵敏、快速等特点.

松材线虫PCR标准化阳性对照构建及检测体系的建立

建立了松材线虫PCR检测标准化阳性对照及特异性强的PCR检测体系.根据松材线虫rDNA-ITS区和BxPe12基因的特异基因序列设计引物,并从中筛选出一对特异引物cqubs01/cquba01,该引物能从松材线虫特异性扩增出196bp片段,而不能对其他种类线虫进行扩增.基于优化PCR反应体系和反应程序,稳定的检测体系得以建立,检测灵敏度为100pg/μL.以松材线虫基因组DNA为模板,以上述特异引物进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物与PMD18-T载体连接之后转入大肠杆菌中,筛选出阳性克隆进行测序验证,最终获得了松材线虫的无害化阳性对照,建立了松材线虫标准化阳性对照的PCR检测体系.对来自于不同地区的12批次近100个样品进行了实际检测验证,其结果与实际发生情况一致,说明本检测体系稳定可靠.

基于TaqMan实时荧光PCR的拟松材线虫分子鉴定技术

拟松材线虫与松材线虫的亲缘关系极为接近,是松材线虫病病原鉴定的主要干扰物种。为了排除松材线虫病病原鉴定过程中拟松材线虫的干扰,采用TaqMan实时荧光PCR技术,以核糖体DNA内转录间隔区(ITS)为模板设计拟松材线虫特异性引物和TaqMan探针,开展拟松材线虫分子检测和鉴定技术研究。结果表明:拟松材线虫ITS2区域存在较多的碱基差异,以此为模板设计的拟松材线虫引物和TaqMan探针组合具有较强的特异性;该组合灵敏性高,能够实现对拟松材线虫单条线虫甚至单个卵的分子检测和鉴定。结合现有的松材线虫分子鉴定技术,可以为进一步构建松材线虫双重检测技术体系奠定基础,为林业和海关检疫提供可靠的技术支撑。

进境木片松材线虫PCR检测方法研究

利用松材线虫rDNA内转录区(ITS)特异性引物,对泉州口岸入境木片携带的线虫基因组DNA进行特异性PCR扩增,建立一套快速准确的线虫检测鉴定方法。将该检测方法应用于泉州口岸现场检疫鉴定,结果未检测到松材线虫,与传统形态学鉴定方法结果一致。

松材线虫微滴式数字PCR检测体系的建立

【目的】建立松材线虫微滴式数字PCR检测体系,验证该检测体系的有效性,为松材线虫检测提供一个更精确灵敏的定性检测方法。【方法】基于松材线虫16S rDNA基因序列,使用在线工具设计特异性引物和探针。优化PCR反应条件,明确微滴式数字PCR的最佳反应条件。再以采集自不同地区的6株松材线虫和12株拟松材线虫、滑刃线虫、伞滑刃线虫、垫刃线虫的基因组DNA溶液为模板对该体系的特异性进行检测;以稀释10倍的标准DNA为模板,设置不同浓度梯度来验证该体系的灵敏度;以3个不同浓度的DNA标准品稀释模板检测微滴式数字PCR的可重复性。最后以人工模拟添加线虫样品和感病松木样品DNA提取液为模板对该体系的实用性进行验证。【结果】①设计了松材线虫特异性引物探针一组,引物:P1904-F、P2057-R;探针:Probe-1938。②PCR反应体系经优化,确定其最佳退火温度为55℃。③特异性验证表明,设计的引物探针可以将松材线虫与其他相近种的线虫区分开。④灵敏度检测结果发现,该检测体系的检出浓度在0.51~20000 copies/μL。⑤对3组不同浓度标准样品的可重复性检测发现,该检测体系的变异系数在9.12%~0.31%,并且样品浓度与变异系数呈负相关。⑥使用该检测体系检测林间感病松木样品和人工模拟加入松材线虫的样品发现,该检测体系能够特异地检测出样品中的松材线虫,且拷贝数与样品中的线虫量呈正向相关。【结论】本研究建立了松材线虫微滴式数字PCR检测体系,该方法特异性好,检测灵敏度高,变异系数小,可高效地检测出样品中的松材线虫。该体系的建立可为松材线虫病理学和生态学研究提供可靠的研究数据。

3种松材线虫分子检测技术的比较分析

分别用特异性引物法、ITS-PCR-RFLP法和实时荧光PCR法对松材线虫进行了检测,通过检测时间、检测精度和操作情况等方面的比较得出:特异性引物PCR法操作简便、成本低,是目前的常规检测技术;ITS-PCR-PFLP法可以鉴定到小种,相比特异性引物法更具说服力,但耗时较多,适用于线虫种群分化研究和种类鉴定,而不适合作为一种快速检测技术;实时荧光PCR法耗时短,灵敏度高,操作简便安全,只是仪器设备要求较高,适合松材线虫的口岸检验检疫工作。

松材线虫两种实用分子检测技术

为检验已开发的SCAR标记与实时PCR两种分子检测方法鉴定松材线虫的可靠性,本文选用线虫未知种样品7个以及已知种样品3个为实验材料,采用上述两种分子检测方法进行检测,并且对7个线虫未知种样品进行形态鉴定。结果表明:1)运用SCAR标记检测,第2、3、4、7号4个未知种样品与8号松材线虫样品出现了一条清晰、明亮的860bp特异条带,第1、5、6号样品与9号拟松材线虫、10号大核滑刃线虫均未出现扩增谱带,表明第2、3、4、7号4个待测样品中含有松材线虫,而第1、5、6号3个待测样品中不含有松材线虫;2)运用实时PCR检测,第2、3、4、7号4个样品与8号松材线虫样品表现有明显的阳性扩增信号,其余样品均未出现扩增信号,也无循环阈值(Ct值);3)对7个未知种样品的形态鉴定结果为:第2、4、7号样品为松材线虫样品,3号样品中除松材线虫外还含有其他线虫,第1、5、6号3个样品不含松材线虫。对于松材线虫的检测,两种分子检测结果与形态鉴定结果完全一致,且两种分子检测方法对松材线虫都具有很强的特异性,都可以在较短时间内对松材线虫进行鉴定。其中SCAR标记检测方法约需2h,实时PCR检测方法约需1h。实现了对松材线虫幼虫快速检测目标,检测结果便于判读。

松材线虫rNDA-ITS1区分子检测与鉴定

利用两对松材线虫特异性引物,分别对来自日本、美国和葡萄牙的松材线虫虫样进行PCR检测,成功扩增出330 bp和220 bp rDNA-ITS1区基因片段,该方法对松材线虫成虫或幼虫均能作出准确鉴定。

可视化核酸试纸条法快速检测松材线虫

建立了快速、可视化检测松材线虫的方法,分别设计一对特异性引物和一条竞争引物,其中上、下游引物的5′端分别修饰有生物素(biotin)和荧光素(FITC);通过试验筛选并确定了竞争引物的最适比例从而避免核酸试纸条检测扩增产物的假阳性结果,实现了松材线虫的可视化检测。该技术具有操作便利、特异性强、灵敏度高,结果直观、稳定、可靠等优点,在口岸检验检疫实验室快速鉴定松材线虫方面具有良好的应用前景。

运用MuPS标记识别马尾松抗松材线虫病个体

运用14个SCAR标记引物对松材线虫病马尾松(Pinus massoniana)抗性候选个体开展MuPS(Multiplex-PCR of SCAR markers)分析。结果表明,120个样品中出现104个不同的MuPS型,区分率86.7%、74.2%的个体完全能够被识别。引物Pmscar157、Pmscar007、Pmscar053的多态位点数出现率非常高,分别占总位点数的13.1%、13.3%、18.4%,而引物Pmscar039、Pmscar499的位点数出现率非常低,分别占总位点数的0.16%、0.48%。因引物重复性高、稳定可靠,可通过获得的MuPS型识别抗性候选个体、管理抗性候选家系。

日本木质包装中截获的伞滑刃属线虫鉴定

天津局从来自日本的木质包装材料中截获1种松材线虫近似种。通过形态特征观察和形态测量数据比较以及核糖体内部转录间隔区(rDNA-ITS)的PCR-RFLP分析,鉴定该分离物为豆伞滑刃线虫Bursaphelenchus doui。

基于PCR技术的松材线虫分子检测技术研究进展

松材线虫是世界性检疫对象,并对我国林业造成了严重的危害。由于线虫个体较小且鉴定特征单一,利用传统的形态学鉴定较为困难,因此客观的分子生物学鉴定方法显得尤为重要。本研究总结了近些年主要的松材线虫PCR检测技术及其与拟松材线虫的区别,阐述了常规PCR技术、PCR-PFLPs检测技术、RAPD和SCAR分子标记技术以及荧光PCR技术等各类检测技术的特异性序列、片段大小和应用场景,并探讨了各检测技术的优缺点,为后期研究提供参考。

松材线虫病双基因检测方法的建立

采用松材线虫的核糖体DNA的内转录区序列及cathepsin L-like cysteine proteinase为目的片段设计2对引物,建立了可特异性检测松材线虫的双基因PCR检测法。利用这2对引物,松材线虫可扩增出大小分别为490 bp及264 bp的产物,而其他对照组均无扩增。此检测方法经过实际应用检验,灵敏度与常规PCR一致,而特异性更高,可以应用于实验室的常规检测需求。