节丛孢属丝孢菌对松材线虫和拟松材线虫的捕食

利用节丛孢属捕食线虫真菌的 8个种 ,1 1个菌株 ,对松材线虫 (Bx)和拟松材线虫(Bm)进行了捕食力的测定。结果显示节丛孢属真菌对这两种线虫的捕食能力既存在种间差异 ,也存在同种不同菌株间的差异。指状节丛孢的 3个菌株Ad 1 ,Ad 2 ,Ad 3菌株对两种线虫均表现出较高的捕食率 ,接种 7d后对Bx和Bm的捕食率分别达到了 98 0 8%,91 1 6 %,86 3 %和 96 2 8%,90 45 %,85 3 8%;同一菌株对松材线虫和拟松材线虫的捕食没有选择性。此外 ,通过对松材线虫和拟松材线虫繁殖真菌的筛选实验 ,肯定了利用拟松材线虫代替松材线虫进行生防菌株筛选的可行性。

应用PCR-RFLP技术鉴别松材线虫与拟松材线虫

应用PCR-RFLP技术分析松材线虫与拟松材线虫之间的差异。实验扩增出松材线虫rDNA-ITS区片段长度约为890 bp,拟松材线虫rDNA-ITS区片段长度约为930 bp。用5种限制性内切酶对两种线虫的ITS区扩增产物进行酶切,结果表明:(1)DraI酶切松材线虫群体均产生两个长度约510 bp和380 bp的片段,而拟松材线虫均不能被DraI酶切;(2)所有的松材线虫群体与拟松材线虫群体的ITS区扩增产物均不能被ApaI酶切;(3)用MspI酶切松材线虫群体,除GZ02不能够被酶切外,其余样本能够产生两条长度分别为530 bp和360 bp的谱带。拟松材线虫群体,都能产生3条一致的亮带,长度分别为340 bp2、90 bp、180 bp;(4)所有松材线虫样本均不能被SalI酶切,而拟松材线虫群体均能够被酶切为两个720 bp和220 bp的片段;(5)XhoI酶切松材线虫ITS区为两条大小分别为520 bp和370 bp的谱带。而拟松材线虫产生两条大小分别为530 bp和400 bp的谱带。因此,内切酶DraI、SalI可以用于检测松材线虫与拟松材线虫。MspI、ApaI、XhoI不宜用于鉴别松材线虫与拟松材线虫。

松材线虫与拟松材线虫RAPD检测技术

采用RAPD技术对松材线虫和拟松材线虫进行了检测研究,从140个随机引物中筛选出引物OPK09与引物组合OPC18+OPN18。引物OPK09对12个松材线虫株系扩增出一条约2400bp左右的特异片段,引物组合OPC18+OPN18对10个拟松材线虫株系扩增出一条970bp左右的特异片段。实验表明,引物OPK09与引物组合OPC18+OPN18具有特异性强、灵敏度高的优点。用这两组引物可以快速、准确鉴定松材线虫和拟松材线虫。

利用rDNA的PCR-RFLP对伞滑刃属线虫群体的分子鉴别

应用对rDNA中ITS的PCR-RFLPs技术和方法对来自中国、日本和韩国的松树或木质包装箱中分离出来的伞滑刃属(Bursaphelenchus)6个线虫群体进行了分子鉴定.其中来自浙江镇海的松树和日本的木质包装箱中分离出的各一线虫群体被鉴定为松材线虫(B.xylophilus),而来自浙江富阳的松树和韩国、香港及日本的木质包装箱中的另一个群体等4群体被鉴定为拟松材线虫(B.mucronatus).本研究中选用的4种限制性内切酶(Hinf 、Hae 、Msp 、cfo )的特异性酶切位点均可以有效地鉴别松材线虫和拟松材线虫.

松材线虫和拟松材线虫种间及种下群体的RAPD指纹分析

利用ＲＡＰＤ技术对松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）和拟松材线虫（Ｂ．ｍｕｃｒｏｎａ－ｔｕｓ）的分离物基因组ＤＮＡ进行了ＤＮＡ片段的随机扩增，以确定种间及种内群体的亲缘关系和筛选具有种鉴定特征的分子标记．通过对４０个１０聚体随机引物的筛选，应用８个引物对两种线虫种间及种内分离物扩增片段的遗传分析显示：两种间群体ＲＡＰＤ扩增片段的共享度为４０％～５６％，而在松材线虫的不同分离物之间的共享度为６０％～８４％；其中有一个引物（Ｐ２５３）可在松材线虫和拟松材线虫种间产生具有种鉴定特征的特异性ＲＡＰＤ片段，在松材线虫的不同分离物中均可产生一约７００ｂｐ的特异性片段，而在拟松材线虫中产生了两个分别约为１３００ｂｐ和１９００ｂｐ的特异性片段．

松材线虫和拟松材线虫的繁殖力及其超氧自由基差异

采用不同毒力的松材线虫和拟松材线虫进行研究,探讨不同毒力线虫的繁殖力及虫体自身超氧自由基(O.2)释放能力差异与各虫株致病力之间的关系。对强、弱毒松材线虫和无毒拟松材线虫在单异活体培养下的繁殖力进行测定,发现三者的繁殖力从大到小依次为:无毒拟松材线虫、强毒松材线虫、弱毒松材线虫。单异活体培养下的松材线虫和拟松材线虫虫体、水培滤液的超氧自由基测定表明,两组分中的超氧自由基含量与供试线虫的毒力呈负相关,从高到低依次为:无毒拟松材线虫、弱毒松材线虫、强毒松材线虫。结果表明:供试的不同毒力松材线虫和拟松材线虫的致病力与其繁殖力无显著相关性,但与其虫体超氧自由基含量有密切关系。

国内部分地区松材线虫和拟松材线虫基因多态性的RAPD分析

采用SDS法提取线虫基因组DNA,分别选取了6种随机引物对部分地区的10株松材线虫和10株拟松材线虫进行随机扩增和亲缘关系比较。RAPD的结果可以明显区分松材线虫和拟松材线虫,与形态学分类相吻合。聚类分析的结果也表明,线虫种内和种间均存在差异,但种间差异明显大于种内差异,同种线虫在同一地区或临近地区的同源性明显高于其它地区,同一地区内寄主对线虫种类分布的影响较小。该方法具有所需样品量少、检测灵敏度高、结果准确等优点,为松材线虫种群的亲缘关系、传播途径及其检测防疫等方面提供一种灵敏、可靠的研究方法。

黑松与松材线虫和拟松材线虫互作早期超氧自由基研究

为探讨黑松受不同毒力松材线虫与无毒拟松材线虫侵染后,超氧自由基(O2.-)在互作早期对松材线虫病发生发展的作用,采用2年生黑松接种强毒、弱毒松材线虫与无毒拟松材线虫,于接种后4、12、24、48、72、96、120 h对受侵染黑松的茎干和针叶取样测定。结果表明:黑松受不同毒力供试线虫侵染后体内O2.-和SOD活性变化差异显著。接种后12 h,松树茎、叶中的O2.-均出现第1次突增,茎部突增的强度与供试线虫毒力呈负相关,在针叶内O2.-出现第2次突增,且无毒拟松材线虫处理(48 h)的启动时间早于强毒松材线虫(72 h)的。SOD活性在接种无毒拟松材线虫的松树茎、叶中出现两次突增,而接种强毒松材线虫的处理仅出现1次突增。3种处理黑松茎、叶的Mn-SOD含量在24 h后第1次突增,且接种无毒拟松材线虫的高于接种强毒松材线虫的。O2.-与SOD的变化趋势在一定程度上呈正相关关系,但SOD的特异变化滞后于O2.-的变化。由此可见,超氧自由基可能是松树受松材线虫侵染后进行信号转导的重要桥梁物质。

松材线虫和拟松材线虫不同株系酶电泳的研究

应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对来自国内及日本、加拿大、法国、挪威的松材线虫及拟松材线虫株系作酶电泳的初步分析。结果表明，不同株系的苹果酸脱氢酶及纤维素酶酶谱各不相同。超氧化物歧化酶有１条在不同株系中迁移率相同的酶带。松材线虫与拟松材线虫在酯酶谱上差异明显，但培养于裂褶菌、多毛孢和葡萄孢上的来自南京黑松上的同一株系线虫的酯酶谱也显示了明显差异，表明了该酶的不稳定性。谷氨酸草酰乙酸转氨酶是唯一可区分两种线虫的酶，松材线虫只有１条迁移率０．３９的带，拟松材线虫只有１条迁移率０．５１的带，可用于两种线虫的生化鉴定。对可溶性蛋白质及过氧化物酶的分析，未检测到清晰可辨的酶带。

不同致病力线虫接种黑松后寄主体内组织病理学变化

分别用强、弱致病力松材线虫和无致病力拟松材线虫接种2年生黑松苗,发现不同致病力线虫在黑松苗体内的迁移特性不同,导致黑松苗产生的组织病理学变化也有差异。强致病力松材线虫扩散主要通过轴向树脂道在树体内上下扩散,通过径向树脂道在树体内向外扩散,并以此成为逾越形成层的通道,由于松属植物树脂道是遍布整个树体的一个"管网系统",所以线虫扩散速度快;弱致病力松材线虫扩散主要在皮层中,扩散速度慢,致病速度慢;无致病力拟松材线虫主要分布在皮层中,仅仅在少数皮层树脂道中发现线虫,而其对韧皮部、维管形成层细胞、木质部的射线细胞和树脂道周围的薄壁细胞未造成影响,也不能大量繁殖,因而对黑松不致病。无论是强致病力松材线虫还是弱致病力松材线虫接种后均未观察到线虫直接侵入松树形成层细胞,形成层细胞的死亡是一个渐进的过程,与线虫未到达的树脂道上皮细胞等薄壁细胞的死亡方式类似。

松材线虫和拟松材线虫雄虫交合伞形状的比较

松材线虫和拟松材线虫雄虫交合伞形状的比较刘伟，杨宝君关键词松材线虫，拟松材线虫，雄虫交合伞松材线虫病是松树的一种毁灭性病害。病原松材线虫ＢｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓＮｉｃｋｌｅ（简作Ｂｘ）的形态与非病原拟松材线虫Ｂ．ｍｕｃｒｏｎ...

松材中两种重要线虫比较的研究

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和拟松材线虫(B.mucronatus)被进一步证明是两个不同的种。除表现致病力差异外,形态上具有明显的不同特征,特别是前者交合伞卵圆形,后者平截形;生理学试验表明二者不能交配产生后代;生物化学方面的差异是:酯酶凝胶电泳中松材线虫酯酶带3条,迁移率分别为0.42、0.45、0.49;而拟松材线虫只1条酯酶带,迁移率为0.65。二者脂肪酸总量、不饱和度、短链和长链脂肪酸含量都有明显的差异。

松材线虫和拟松材线虫14-3-3蛋白基因全长cDNA克隆与分析

[目的]对松材线虫和拟松材线虫的14-3-3蛋白基因进行全长cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank数据库中14-3-3蛋白EST序列BXC56(登录号为FG589472)、BMC120(登录号为FG589351),采用RACE技术获取松材线虫和拟松材线虫14-3-3蛋白的全长cDNA克隆Bx14-3-3a和Bm14-3-3a,并对克隆片段序列进行分析。[结果]Bx14-3-3a全长1 039 bp,包含一个756 bp的开放阅读框,编码蛋白含有251个氨基酸残基,包含2个14-3-3蛋白标签,编码蛋白分子量为61.43 kD,等电点为4.88。Bx14-3-3a基因组结构中包含4个外显子和3个内含子序列。Bm14-3-3a全长992 bp,有与Bx14-3-3a编码完全相同的氨基酸序列。序列比对结果表明,14-3-3在真核生物间高度保守,Bx14-3-3A和Bm14-3-3A蛋白在系统进化上与线形动物门(Nematomorpha)的物种近缘关系较近,与植物线虫南方根结线虫(Meloidogyne incognita)系统发育关系上最为亲近。[结论]Bx14-3-3a和Bm14-3-3a的成功克隆,为进一步研究其功能及其调控因子对形态、致病力、繁殖力和环境适应性等方面的分子调控机制奠定了重要基础。

松材线虫与拟松材线虫hsp70和hsp90基因结构特征及其分子进化

转录组的多态性是探讨物种多样性与分子进化的重要方面。笔者选取物种间保守性较高的HSP70、HSP90蛋白作为研究对象,探讨二者在松材线虫和拟松材线虫基因组中的结构差异,探明他们在松材线虫和拟松材线虫中的特点,并试图揭示两种线虫的系统发育关系。结果表明二者内含子具有丰富的多态性,内含子中的G+C含量也显著不同。核酸序列gABG和gmc2分别编码松材线虫和拟松材线虫HSP70的642个氨基酸,相似性高达99%,仅存在9个氨基酸的差异,并且这种差异是由13个碱基的多态性造成的。gABO和gmc19分别编码松材线虫和拟松材线虫的HSP90,其氨基酸序列相似性为92%。对同义密码子的偏好性分析表明,17种氨基酸对应的58个密码子中,gABG和gmc2存在10个密码子差异,gABO和gmc19存在5个密码子差异。采用邻接法分别构建的系统进化树表明松材线虫与拟松材线虫hsp70和hsp90在系统发育关系上最为接近,并与其他线性动物门物种高度同源。

不同致病力线虫侵染后黑松的水势和根系活力的变化

分别用强、弱致病力松材线虫虫株和无致病力拟松材线虫虫株接种2年生黑松,观测接种后不同时间段黑松茎段水势和根系活力变化情况。结果表明:接种强、弱致病性松材线虫虫株后,在未表现出明显症状时,黑松水势都有一个降低然后回升的过程,但当树体内线虫开始大量繁殖、外部表现萎蔫症状时,黑松水势发生不可逆转的急速降低,松树死亡,强致病性松材线虫虫株比弱致病性松材线虫虫株导致黑松茎水势丧失速度快。接种无致病力拟松材线虫后,开始黑松水势下降,然后缓慢回升接近正常水势,随着线虫的死亡,树体水势恢复正常。接种3种线虫虫株后,黑松根系活力随着线虫的侵入都有一个升高的过程,接种强、弱致病力松材线虫虫株后,黑松出现萎蔫时,根系活力虽然有所下降,但仍然保持较好的根系活力,直到松树干枯后根系活力才丧失,这与干旱胁迫下,植物首先丧失根系活力然后表现萎蔫不同;接种无致病力拟松材线虫后,随着拟松材线虫在黑松体内的死亡,黑松的根系活力在升高后逐渐恢复正常。

松材线虫和拟松材线虫家系建立及其致病力测定

遗传背景相对一致、致病力稳定的植物线虫材料是开展其遗传学和致病机制研究的基础。对分别来自中国和日本的4个松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和1个拟松材线虫(B.mucronatus)虫株采用两条幼虫配对在葡萄孢(Botrytis cinerea)基质上进行单异活体共培养的方法获得了若干个遗传背景相对一致线虫家系,家系成功率为13.3%～20%。线虫家系在盛有灰葡萄孢培养基质的、直径为9 cm的培养皿上取食完全所需的时间为10～44天。对不同家系进行了致病力测定表明,家系间的致病力分化明显。综合考虑感病率、感病指数、接种松苗死亡历期等指标,其中松材线虫家系AN19#F1的致病力最强,而拟松材线虫虫株AN5#所建家系都没有表现致病力。