法氏囊三肽囊素(Bursin)的研究 Ⅱ.Bursin在鸡体免疫器官中免疫组织化学的定位

以抗Ｂｕｒｓｉｎ单抗２Ｆ９－４，用免疫组织化学方法，检测Ｂｕｒｓｉｎ在鸡胚胎期及出壳后１～９周龄雏不同免疫器官中的定位分布。结果表明：胚胎期１２日龄囊（上皮芽、上皮）、骨髓呈阳性；１４日龄囊（上皮芽、芽突）、胸腺髓质有阳性细胞；２０日龄胸腺有阳性细胞。新生雏囊单层或假复层上皮ＦＡＥ和ＩＦＳＥ呈阳性、髓质有稀少ＤＲＥＣ阳性、ＣＭＥ弱阳性。出壳１～３周ＤＲＥＣ与哈德氏腺阳性，反应随周龄增加有所增强，胸腺髓质呈阳性，３周脾脏极少数散在阳性细胞。４周ＣＭＥ、ＤＲＥＣ、ＩＦＳＥ与ＴＤＩＡ的基底膜有阳性细胞。６周ＦＡＥ、ＦＡＥＳＣ、ＣＭＥ、ＤＲＥＣ、ＩＦＳＥ与ＴＤＩＡ的基底膜有阳性细胞。８周ＦＡＥ、ＦＡＥＳＣ、ＣＭＥ、ＤＲＥＣ呈阳性。９周ＣＭＥ、ＤＲＥＣ呈阳性。４，６，８，９周Ｈａｓａｌ小体、６，９周骨髓呈阳性；４，６周脾脏散在阳性细胞；４，６，９周哈德氏腺有阳性细胞。

动物源性免疫活性因子生物学特性的研究 Ⅰ.腔上囊活性肽 (Bursin)在鸭体免疫器官中免疫组织化学定位

以抗Bursin单克隆抗体2F9-4,采用免疫组织化学的方法,检测Bursin在鸭初生雏(NH)及1至12周龄免疫器官(腔上囊、胸腺、淋巴结、脾脏和哈德氏腺)中的定位分布.结果表明:Bursin阳性细胞在中枢免疫器官中的分布与显色反应强度跟鸭体本身生长发育分化规律呈阶段相关.尤其在腔上囊滤泡相关上皮(FAE)、FAE支持细胞(FAESC)、滤泡间表面上皮(IFSE)(为单层或假复层上皮)、树突网状上皮细胞(DREC)、皮髓分界上皮(CME)和腔上囊T细胞弥散浸润区(TDIA)等区域,均获得特征性阳性结果.

法氏囊三肽囊素(Bursin)的研究Ⅰ.抗 Bursin 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以戊二醛法制备ＢｕｒｓｉｎＫＬＨ，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取脾细胞，以ＰＥＧ为融合剂，与ＳＰ２融合，用间接ＥＬＩＳＡ法筛选出与Ｂｕｒｓｉｎ－ＢＳＡ结合、不与ＢＳＡ结合的２Ｆ９－４克隆株，经鉴定，抗体属性为ＩｇＭ，Ｋ轻链。水溶性Ｂｕｒｓｉｎ可阻抑２Ｆ９－４对鸡法氏囊的反应，切片标本经ＰＢＳ处理，反应性消失，免疫组织化学染色于法氏囊上获得特征性阳性结果。

三肽囊素Bursin对鸭疫里氏杆菌病灭活苗免疫效果的影响

选择240枚静脉清晰的13日龄樱桃谷鸭胚,随机分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4组,每组60枚,第Ⅰ组为生理盐水对照组,第Ⅱ组为低浓度(10-6μg/mL)Bursin组,;第三组为中浓度( 10-3μg/mL)组,第四组为高浓度( 10-2μg/mL)组,皆于13日胚龄时分别静注生理盐水和不同浓度Bursin各0. 1mL/胚。以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组鸭出壳后0、14、21、30、36、42日龄时的鸭疫里氏杆菌抗体效价。结果表明,低浓度Bursin对鸭疫里氏杆菌抗体的产生有较强的促进作用,而中、高剂量Bursin反而有一定的阻抑效应。

三肽囊素(Bursin)模拟肽阳性噬菌体对新城疫疫苗免疫效果的影响

研究了两个噬菌体展示三肽囊素模拟肽阳性噬菌体的活性。将100羽1日龄罗曼鸡随机分成5组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组),每组20羽,在2日龄时,Ⅰ组注射4号阳性噬菌体(滴度为211),Ⅱ组注射6号阳性噬菌体(滴度为211),Ⅲ组注射6号阳性噬菌体(滴度为29),Ⅳ组注射一定剂量的Bursin,Ⅴ组为TBS对照组,在8日龄时接种新城疫(ND)Ⅳ系苗,以后每隔1周采用微量血凝抑制试验和MTT法测定各组的免疫效应。结果表明:阳性克隆(4号和6号)与Bursin在动物试验上具有相似的免疫增强作用,能提高体液免疫水平,对细胞免疫也有提高,且这种促进作用的大小与所用噬菌体滴度有关。

鸡源Bursin-ScFv噬菌体展示文库的构建及初步筛选

本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板,根据来航鸡IgG抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增。在体外扩增出该抗体的可变区VH和VL基因(大小分别约为370和320 bp)。通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,将ScFv DNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素独特型抗体全套单链噬菌体抗体库。并测得该库容量约为5×105,噬菌体中ScFv基因的插入率为80%,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为1011PFU/mL的初级噬菌体抗体库。用抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛,出现特异性富集。经ELISA、动物试验表明所筛选的5个阳性克隆可与抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)特异性结合,并能促进抗体的生产。

三肽囊素(bursin)的鸡、鸭免疫器官组织学定位特征分析(简报)

三肽囊素(bursin)是法氏囊组织提取物中一种非常重要的活性因子,由Audhya T.等在1986年首次报道[1].

Characteristics of histological location of bursin in sacculus rotundus and gut-associated lymphoid tissues of rabbits

The distribution of bursin in sacculus rotundus and gut-associated lymphoid tissues was investigated in rabbit by immuno-histochemical staining method with anti-bursin monoclonal antibody （McAb）2F9-4. The results indicated that the appearance of the bursin-containing cells coincided with the morphodifferentiation and growth process in rabbit. Bursin immunized cells not only distributed in dome epithelium and mucosal epithelium, but also in follicular germinal center, dome, T-cell area, goblet cell, inter-epithelial lymphocyte and cap-zone of sacculus rotundus. This founding suggested that bursincontaining cells in sacculus rotundus might play an important role in intestinal mucosal immunity.

抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体的制备及其与三肽囊素分子结合特性分析

为研制抗三肽囊素(Bursin,KHG-NH2)单克隆抗体(MAb),本研究采用EDC法、SMCC法将Bursin分子赖氨酰(K)上的氨基与载体蛋白(BSA、OVA)定向偶联,分别制备Bursin人工抗原BSA-KHG-NH2、OVA-KHG-NH2和BSA-S-KHG-NH2。以BSA-KHG-NH2免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术,筛选得到二株能够稳定分泌抗Bursin MAb的杂交瘤细胞株,命名为4A11和7B2。这二株MAbs均能够与BSA-KHG-NH2、OVA-KHG-NH2和BSA-S-KHG-NH2反应,不能与BSA和OVA反应;MAbs与OVA-KHG-NH2的反应均能够被KHG-NH2、GKHG-NH2、HHHHHHKHG-NH2肽阻断,但不能被KHGK四肽阻断。结果表明,在Bursin分子甘氨酰胺(G)上的氨基未与其他氨基酸连接时,本实验制备的二株MAbs均能够与Bursin分子特异性结合。抗Bursin MAbs的制备,为进一步以MAb为靶分子筛选Bursin模拟表位、Bursin的生物活性关键基团等研究奠定了基础。

三肽囊素对鸡脾脏淋巴细胞增殖转化、IL-2和IL-6分泌及其基因表达的影响

为探讨人工合成的三肽囊素(BS)作为新型免疫增强剂的作用机制,本研究采用MTT比色法、放射免疫测定法(RIA)和相对半定量RTPCR法,分别研究了BS对体外培养的鸡脾脏淋巴细胞的增殖、对白细胞介素2(IL2)和白细胞介素6(IL6)分泌及其mRNA表达水平的影响。试验结果表明,0.5μg/ml、5μg/ml和50μg/mlBS处理36h,均可显著提高ConA诱导的脾脏淋巴细胞的增殖反应性;5μg/mlBS处理能显著促进脾脏淋巴细胞分泌IL6,显著升高IL6mRNA表达水平,但对IL2的分泌及其mRNA表达水平无显著影响。本研究结果进一步提示,BS可能主要通过激活IL6基因的表达和促进脾脏淋巴细胞的增殖反应。

三肽囊素对环磷酰胺诱导的免疫器官细胞凋亡的影响

研究了三肽囊素对环磷酰胺诱导的鸡免疫抑制模型中免疫器官细胞凋亡的影响。将 180只 1日龄粤黄鸡随机分成环磷酰胺组、正常对照组、三肽囊素组以及三肽囊素 +环磷酰胺组。利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 d TUP缺口末端标记法 (TUNEL) ,对不同组鸡的免疫器官细胞凋亡进行计数。结果发现 ,环磷酰胺组细胞凋亡数比对照组明显增多 (P<0 .0 5 ) ,而三肽囊素 +环磷酰胺组细胞凋亡数显著少于环磷酰胺组 (P<0 .0 5 ) ;三肽囊素组的细胞凋亡数比环磷酰胺组少 ,且差异显著 (P<0 .0 5 )。由此可知 ,三肽囊素对环磷酰胺所诱导的细胞凋亡具有抑制作用。

法氏囊活性肽对鸡传染性法氏囊病弱毒疫苗免疫效果的影响

将不同剂量的法氏囊活性肽 (BS)冻干粉与鸡传染性法氏囊病 (IBD)弱毒疫苗混合 ,对 2 1日龄SPF鸡滴鼻点眼 ,另设免疫对照组和生理盐水对照组 ,于免疫后 7d、10d、14d、2 1d、2 8d、45d、6 0d、75d和 90d采血 ,测定AGP抗体效价 ,并于免疫后 7、14、2 1、2 8d ,每组剖杀 2只 ,计算试验组囊指数与空白对照组囊指数之比 (BBIX) ,免疫后 30d用IBD JS株攻毒。结果表明 :免疫后 7d ,0 48mgBS IBD弱毒苗组AGP抗体阳性率为 5 2 9% ,比免疫对照组高 2 5 % ,BBIX数值也稍大 ;免疫后 45d抗体水平达到高峰时 ,0 96mgBS IBD弱毒苗组的抗体效价比免疫对照组高2个滴度 ,BBIX数值也稍大于免疫对照组。 30d后攻毒 ,各免疫组的攻毒保护率均为 10 0 %。整个试验期间 ,1 92mgBS IBD弱毒苗组的AGP抗体效价及BBIX数值与免疫对照组相比差异不显著。结果表明 :BS在增强机体免疫应答、提高对法氏囊的保护及损伤后的修复作用方面与其剂量有一定的关系。

乳酸杆菌和囊素三肽对肉鸡生长性能、屠宰性能、肉质和血清生化指标的影响

本试验通过在基础饲粮中添加乳酸杆菌制剂或肌肉注射囊素三肽,研究乳酸杆菌和囊素三肽对肉鸡生长性能、屠宰性能、肉质和血清生化指标的影响。选用1日龄科宝肉鸡180只,随机分成4组,每组3个重复,每个重复15只鸡。Ⅰ组饲喂基础饲粮;Ⅱ组饲喂基础饲粮,并肌肉注射囊素三肽(0.01 mg/kg BW);Ⅲ组饲喂基础饲粮+0.1%乳酸杆菌制剂;Ⅳ组饲喂基础饲粮+0.1%乳酸杆菌制剂,并肌肉注射囊素三肽(0.01 mg/kg BW)。试验期42 d。结果表明:1)Ⅱ和Ⅳ组平均日采食量极显著高于Ⅰ和Ⅲ组(P<0.01),但平均日增重和料重比组间差异不显著(P>0.05)。2)Ⅱ组半净膛率极显著高于Ⅰ组(P<0.01),各组屠宰率、全净膛率、胸肌率、腿肌率差异均不显著(P>0.05)。3)Ⅱ和Ⅲ组肉色优于Ⅰ和Ⅳ组,各组pH差异不显著(P>0.05),Ⅱ和Ⅳ组滴水损失极显著高于Ⅰ和Ⅲ组(P<0.01),Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组剪切力均极显著低于Ⅰ组(P<0.01)。4)Ⅲ组血清中总蛋白和白蛋白含量显著高于Ⅰ组(P<0.05),Ⅲ和Ⅳ组血清中甘油三酯含量显著低于Ⅰ组(P<0.05)。综合各项指标证明,乳酸杆菌和囊素三肽在一定程度上有提高肉鸡生长性能和屠宰性能的作用,并能改善肉鸡肉质及血清生化指标,但两者联合使用的效果并未优于单独使用。

囊素和法氏囊超滤物对杂交瘤细胞抗体分泌的影响

以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞为对象,通过间接ELISA法测定抗体的OD490值。结果表明,随着囊素和法氏囊超滤物浓度的增加,细胞抗体分泌逐渐增加,当囊素浓度为50μg/mL、超滤物浓度为2.5mg/mL时,OD490值达到最高,分别比对照组增加8.83％和5.72％（P<0.01）;随着浓度的继续增加,OD490值开始下降。同时观察到,处理48h后,500μg/mL囊素组和5mg/mL法氏囊超滤物组有部分细胞死亡,1000μg/mL囊素组及40,20,10mg/mL法氏囊超滤物组细胞全部死亡,其它组细胞正常。动态试验表明,加入50μg/mL囊素后3h,OD490值增加最高,达24.93％（P<0.01）。因此,囊素和法氏囊超滤物能直接与杂交瘤细胞作用,并提高其抗体分泌水平。

信号转导抑制剂对囊素刺激杂交瘤细胞抗体分泌及其mRNA表达的影响

以杂交瘤细胞为模型 ,在培养液中加入不同的信号转导抑制剂和囊素 ,用间接ELISA法测定抗体分泌水平 ,用定量RT PCR法检测抗体mRNA的表达水平。结果表明 ,加入Gα 蛋白选择性抑制剂NF 0 2 3、蛋白激酶C抑制剂GF10 92 0 3X、磷脂酰肌醇 3激酶抑制剂heparin、Ca2 + /calmodulin依赖蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN 6 2、磷脂酶C抑制剂U 7312 2和蛋白激酶G抑制剂后 ,囊素对杂交瘤细胞抗体分泌速度的影响明显 (P <0 0 1)。而加入蛋白激酶A抑制剂 4 Cyano 3 M thylisoquinoline、酪氨酸蛋白激酶抑制剂 genistein和丝裂原活化的蛋白激酶抑制剂PD 980 5 9后 ,囊素对杂交瘤细胞抗体分泌速度的影响不明显 (P >0 0 5 ) ,这 3种抑制剂对杂交瘤细胞抗体分泌速度的抑制率分别为 74 5 5 % ,91 13%和80 6 9%。加入 4 Cyano 3 M thylisoquinoline、genistein和PD 980 5 9后 ,囊素处理组与对照组γ1mRNA的表达水平差异不显著 (P >0 0 5 ) ,说明这 3种抑制剂阻断了囊素刺激的杂交瘤细胞抗体mRNA的表达。以上结果表明 ,蛋白激酶A、酪氨酸蛋白激酶和丝裂原活化的蛋白激酶参与了囊素在杂交瘤细胞中的信号转导。

合成法氏囊素和LCGF与卵黄抗体对鸡IBD的治疗作用

应用溶血空斑试验和溶血分光光度测定法分析了合成法氏囊素 ( BS)及其结构类似物—肝细胞生长因子 ( L CGF)对机体抗体形成细胞的影响 ,并进一步研究了二者对IBD的治疗作用。结果证明 ,合成 BS和L CGF均能显著提高小鼠抗体形成细胞的增殖 ,促进小鼠抗 SRBC抗体分泌 ( P <0 .0 1 )。治疗试验表明 ,合成 BS和 LCGF或卵黄抗体单独应用 ,均可显著提高 IBD发病鸡群的成活率 ( P <0 .0 1 )。BS,LCGF单独应用或与卵黄抗体结合的治疗效果均显著高于试验剂量的卵黄抗体 ( P <0 .0 1 ) ,高剂量的 BS能促进病鸡法氏囊损伤的修复。

法氏囊三肽囊素在鸭体中的组织学定位及功能的研究

以抗法氏囊三肽素(Bursin)单抗,采用免疫组化法及个体发生早期以该单抗阻抑Bursin效应,检测Bursin在鸭体定位分布及其受阻抑后所致生物学效应。结果表明,BF髓质内周缘呈现阳性细胞层、髓质中央部分有稀少阳性细胞、FAE及FAESE呈阳性、IFSE中阳性细胞散在性呈团簇状分布;Th中阳性细胞相对集中于髓质中类似Hassall小体的区域或较高密度弥散于髓质中;Sp中阳性细胞弥散于GC中或无特征性散在性分布;HG中阳性细胞呈团块状散在分布于腺泡、腺管基底膜中;LN则阳性细胞特征性存在于淋巴小结中,少数散在淋巴细胞聚集区或淋巴组织索中。不同剂量抗Bursin单抗对鸭体细胞免疫功能有较强阻抑效应,高浓度单抗阻抑作用更显著(P<0 01);对体液免疫功能亦有较强阻抑效应,不同剂量单抗间未见显著差异(P>0 05);对BF指数有较强影响,高剂量组更明显(P<0 05),且高剂量对Sp指数有一定影响;较强地抑制BF滤泡发育,高剂量组BF发育更不良。

枯草芽胞杆菌和三肽囊素对肉鸡生长性能、血液生化和抗氧化指标的影响

选取144只1日龄科宝-500肉鸡,随机分为4组,每组3个重复,每个重复12只。对照组(Ⅰ)和三肽囊素组(Ⅱ)饲喂基础饲料,枯草芽胞杆菌组(Ⅲ)和枯草芽胞杆菌加三肽囊素复合组(Ⅳ)在基础饲料中添加枯草芽胞杆菌1.0×106cfu/g,Ⅱ、Ⅳ组在4日龄和7日龄注射0.01 mg/kg的三肽囊素,试验期为42 d,探讨枯草芽胞杆菌与三肽囊素对肉鸡生长性能、血液生化和抗氧化指标的影响。结果表明:与对照组相比,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组试验前期和全期日增质量显著提高(P<0.05),Ⅳ组料重比最低,较对照组降低4.37%(P>0.05);21日龄时,Ⅲ、Ⅳ组血清总蛋白含量分别比对照组提高19.60%、27.68%(P<0.05),白蛋白含量分别比对照组提高16.72%、18.03%(P<0.05);21日龄的Ⅲ组和42日龄的Ⅳ组的CAT、GSH-Px酶活力显著高于对照组(P<0.05),42日龄时试验组血清MDA显著低于对照组。由此可见,添加枯草芽胞杆菌及其与三肽囊素联合应用能改善肉鸡生长性能,提高血清总蛋白和白蛋白含量,增加CAT和GSH-Px的酶活力。

人工合成的法氏囊活性肽对新城疫弱毒疫苗免疫效果影响的研究

应用人工合成的法氏囊活性肽给鸡两次注射，再应用新城疫弱毒活疫苗，结果表明：应用人工合成的法氏囊活性肽后短期内能够促进法氏囊的生长发育，这种促进作用的大小与应用剂量呈正相关，对脾脏生长发育没有影响。人工合成的法氏囊活性肽能够使血清中新城疫母源抗体保持较高水平和较长时间。

囊素三肽的基因克隆和表达

以合成的BS1、BS2为引物扩增囊素三肽(BS)8串联片段(BS8),克隆至pBAD/Thio-TOPO载体,用pBAD/TOPO○RThio大肠杆菌表达系统进行表达,含BS8融合蛋白的分子量大小约为19kD,BS8融合蛋白主要以可溶形式存在。用蛋白质纯化树脂50%Ni-NTA纯化融合蛋白,高纯度的融合蛋白经透析除咪唑、浓缩后,再经胰蛋白酶水解获得大量BS单体。高压液相色谱分析表明,经过DEAE阴离子交换层析,获得纯化的BS单体。