降糖多肽药物固相合成有关物质研究综述

近年来糖尿病患病人数日益增多,鉴于此,糖尿病类药物发展很快,尤其以多肽类药物发展最快,但大多数多肽药物在体内半衰期短,生物利用度低,因此寻找长效的降糖药物势在必行。目前多肽药物主要通过动植物中提取、化学合成和基因重组三种方式来制备,多肽药物化学合成方法是主要制备工艺之一,但化学合成过程中产生的有关物质会对产品质量有一定的影响。目前多肽药物主要采用固相多肽合成技术,该方法反应容器单一,容易实现自动化,但是该过程容易产生有关物质,并且多肽药物在合成、储存过程中,容易形成相关结构杂质,例如氨基酸丢失、氨基酸插入、保护基残留、氧化/还原等。本文主要介绍多肽药物有关物质,重点从固相合成工艺杂质方面展开综述,调研了国内外目前的研究现状,以期能探索出多肽药物其他的开发关键点,为这类药物的产业开发奠定基础。

化学合成虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ的色谱行为及分离纯化

利用反相高效液相色谱 (RP HPLC)和离子交换色谱 (IEC)比较研究了固相化学合成的多肽类神经毒素虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅰ (HWTX Ⅰ )与其对应的天然产物的色谱行为差异及分离纯化方法。发现在完全相同的实验条件下 ,复性处理后的合成HWTX Ⅰ的谱峰有别于还原变性后又复性的天然HWTX Ⅰ的谱峰 ,主要表现为扩散度较大 ,对称性较差 ,说明合成产物存在更大分子构象的不均一性。推测除了在合成HWTX Ⅰ复性过程中有少数分子发生二硫键错配外 ,还有部分分子在固相合成中发生了消旋作用 。

多肽固相合成的研究进展

多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一,主要可以分为Boc方法和Fmoc方法,在生物药物、蛋白质工程、免疫学等研究中得到了广泛的应用。该文论述了多肽固相合成法的原理,比较了两种典型合成方法的优缺点,介绍了适用于该方法的多肽种类,提出了多肽合成过程中存在的问题与解决策略,最后展望了多肽合成法的应用前景,以供相关领域的研究人员参考。

反相高效液相色谱法分析化学合成胸腺素α_1

利用反相高效液相色谱 (RP HPLC)法 ,对化学合成的胸腺素α1进行了分析。采用PLATINUMC18柱 (2 5 0mm× 4 .6mmi.d .,5 μm ,10nm) ,柱温 :室温 ;流动相A :10 0 %H2 O(含 0 .1%TFA) ;B :90 %乙腈水 (含0 .1%TFA) ,18%B A的等梯度洗脱 ;流速为 1mL/min ;检测波长为 2 14nm ;进样量为 2 0 μL。用外标法定量。实验结果表明 ,该测定方法的检出限为 4mg/L ;平均回收率为 95 .8% ;日内精密度 (用相对标准偏差RSD表示 )均在 10 %以内 ,胸腺素α1在选定的浓度范围内具有良好的线性相关性。该方法简便、快速、准确 ,2 0min内就可以完成一个样品的分析 ,故对胸腺素α1的定量分析具有重要的实用价值。

固相法合成多肽AN-M的工艺研究

目的:探讨生物活性肽AN-M的固相合成工艺,并为工业化合成目的肽提供理论依据。方法采用固相法,以Fmoc-保护基保护的α-氨基酸和Wang树脂为原料,经1—氧—3—双二甲胺羧基苯骈三氮唑四氟化硼盐(TBTU)、1—羟基苯并三氮唑(HoBt)、二异丙基乙胺(DIEA)缩合,20%哌啶的DMF溶液脱保护,用切割试剂将AN-M粗品从Wang树脂上切割下来。结果经反相高效液相色谱分析纯化,可得目的肽的得率大于67．00%,最终成品的纯度在98．78%以上,经质谱鉴定其分子量与理论值一致。结论该合成方法步骤简便、便于操作、产品得率高,可用于大规模合成目的肽。

兔抗大鼠神经甾体合成关键酶P450scc抗体的制备、特性鉴定及应用

目的: 制备兔抗大鼠神经甾体合成关键酶P450侧链裂解酶 (rP450sidechaincleavage, rP450scc)合成肽片段的抗体, 并检测rP450scc在大鼠脑组织及神经细胞中的表达。方法: 利用多肽固相合成法 (Fmoc法 )合成对称的 8分支 16肽rP450scc多重抗原肽片段 (rP450scc- 16), 并以其免疫雄性新西兰兔制备抗rP450scc -16抗体。采用ELISA、Westernblot和免疫细胞化学染色法鉴定抗rP450scc- 16抗体的特性。结果: 于末次免疫后 5d, 动脉放血分离血清, 用ELISA法检测抗rP450scc -16抗体的效价为 1∶6 400。Westernblot检测显示, 抗rP450scc- 16抗血清与大鼠的脑、睾丸及肾上腺组织蛋白于相对分子质量为 50 000处出现一条特异性的条带。用抗rP450scc -16抗体进行免疫细胞化学染色显示, 在正常大鼠的下丘脑、皮质、海马等区及培养的胶质细胞胞质中均可见棕色颗粒。结论: 制备出高特异性的兔抗rP450scc- 16抗体, 该抗体可检测rP450scc在正常大鼠脑组织中的表达和分布。

多肽BRC4的固相法合成及其与RAD51(231-260)的相互作用

采用Fmoc固相合成策略,以Wang树脂为载体,Fmoc保护的氨基酸为原料,HOBT/HBTU/DIEA为缩合剂,经RP-HPLC分离纯化合成了3条多肽(BRC4,BRC4-1和BRC4-2),纯度>90%,其结构经MS(ESI)确证。采用圆二色光谱研究了BRC4,BRC4-1和BRC4-2与蛋白RAD51关键肽段RAD51(231-260)的相互作用。结果表明:3条多肽与RAD51(231-260)的相互作用强度为BRC4-1>BRC4-2>BRC4。

多肽的固相合成法研究进展

介绍了多肽的固相合成法,包括多肽合成原理、发展简史、固相多肽合成的分类、合成中常用的树脂、合成步骤、合成过程中可能出现的副反应以及较长肽链、某些蛋白质的合成策略。

肿瘤放射性受体显像剂奥曲肽的固相合成

采用苏氨酸转变为苏氨酸乙酯,再用LiAlH4还原该乙酯合成了苏氨醇,用自动多肽合成仪和Fmoc(9-芴甲基羰基)保护的氨基酸合成了7肽—树脂;再用三氟醋酸铊(Tl(Tfa)3)在7肽—树脂上形成7肽的二硫键;用苏氨醇氨解法裂解肽—树脂并在7肽链上接上苏氨醇形成八肽;然后用三氟乙酸脱去氨基酸侧链保护基团,用高效液相色谱法纯化八肽,得到了奥曲肽(OCT)。

痛稳素碳末端八肽翻转孤啡肽对抗吗啡镇痛的作用

目的 观察痛稳素碳末端八肽在小鼠脑内对孤啡肽对抗吗啡的镇痛作用的影响。方法 固相多肽合成法合成了痛稳素碳末端八肽 ,用辐射热甩尾法测定痛阈 ,观察 (1)小鼠脑室注射 (icv)孤啡肽对吗啡镇痛作用的影响 ;(2 )小鼠脑室注射 (icv)痛稳素碳末端八肽对小鼠基础痛阈的影响 ;(3)小鼠脑室联合注射 (icv)痛稳素碳末端八肽和孤啡肽对吗啡镇痛作用的影响。结果 孤啡肽可对抗吗啡的镇痛作用 ;痛稳素碳末端八肽本身不影响小鼠的基础痛阈 ,但可逆转孤啡肽对抗吗啡的镇痛作用。

Thr28突变对虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ钠通道活性的影响

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅳ(HWTX-Ⅳ)是从虎纹捕鸟蛛粗毒中分离纯化到的一种新型多肽类神经毒素,能明显抑制表达于大鼠背根神经节细胞的河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道.为了更好地研究该毒素的结构与功能之间的关系,采用芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽化学合成法合成了用谷氨酸(Glu)替代HWTX-Ⅳ第28位苏氨酸残基的突变体T28D-HWTX-Ⅳ,线性多肽合成产物经反相高效液相色谱(HPLC)分离纯化后进行谷胱甘肽氧化复性.复性产物采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术鉴定分子质量,通过全细胞膜片钳电生理技术测定其电压门控钠通道药理学活性.当第28位Thr残基被Glu取代后,突变体T28D-HWTX-Ⅳ对表达于大鼠DRG细胞膜上的TTX-S钠通道的IC50值约为362 nmol/L,对TTX-S钠通道的抑制活性比天然HWTX-Ⅳ(IC50值=30 nmol/L)下降了约12倍,显示第28位的Thr残基是HWTX-Ⅳ与TTX-S型钠通道相互作用的关键活性残基.目前的研究为进一步探索HWTX-Ⅳ的结构与功能关系及新型镇痛药物的研发奠定了基础.

抗鹅膏肽直链的固相合成分析

抗鹅膏肽直链由10个氨基酸组成.采用Fmoc固相合成法,以王氏树脂为固相载体,HBTU-HOBT为缩合试剂,50%哌啶的二氯甲烷溶液为脱保护试剂,50%醋酐的吡啶溶液为酰化试剂;配制三氟乙酸∶乙二硫醇∶水体积比为95.0∶2.5∶2.5,用其作为脱除试剂,将肽链从树脂上切割下来以后,用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析,纯度为64.22%,质谱(MS)进行鉴定,分子量为1 165.结果表明:上述实验方法适合于抗鹅膏肽直链的合成.

α-h-ANF及其类似物的固相合成及活性研究

由计算机辅助设计.以Fmoc-AA-Pfp为单体,用固相法合成了a-h-ANF及其两种类似物,产率较高.兔心血管收缩试验表明,两种类似物的血管舒张活性均高于a-h-ANF.

ω-CTXMVIIA和HWTX-I嵌合体的合成及鉴定

用Fmoc固相多肽合成的方法手工合成了一种ω 芋螺毒素WVIIA和虎纹捕鸟蛛毒素 I的嵌合体 ,用MALDI TOF质谱鉴定 ,表明合成是成功的。此嵌合体可做进一步蛋白质结构与功能研究之用。

2套多肽固相合成装置的设计与应用

根据多肽固相合成的基本原理，设计了２套手工合成装置，介绍了每套装置的操作方法，并阐明了各种装置的优缺点和应用范围。

厚壳贻贝新型抗菌肽myticalin和mytimacin的分子鉴定

从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)血细胞转录组数据中鉴定到两种新型抗菌肽,分别为myticalin和mytimacin。为了解两种抗菌肽的结构与功能,以及在贻贝免疫过程中的响应模式,采用固相化学合成技术获得两种抗菌肽化合物,在此基础上开展了抑菌活性测试,红细胞毒性测试及对微生物抑制作用机理的扫描电镜观察。此外,研究了贻贝在不同微生物诱导下,两种抗菌肽的表达模式。研究结果表明,化学合成的myticalin和mytimacin均具有抑菌活性,但抑菌谱有所差异。两种抗菌肽尽管结构差异较大,但对金黄葡萄球菌和溶藻弧菌的作用机制类似,均能导致细菌表面形态结构发生变化。此外,mytimacin对白色念珠菌表现出明显抑制作用,且其作用机制不同于金黄葡萄球菌和溶藻弧菌,能导致白色念珠菌表面出现孔洞,而myticalin则无此现象。两种抗菌肽在不同微生物诱导后,其表达量均明显上调,但myticalin表现出对革兰氏阳性菌诱导的敏感性,而mytimacin表现出对真菌和革兰氏阳性菌诱导的敏感性。研究为深入了解贻贝抗菌肽的分子多样性及其抑菌活性机制,以及贻贝抗菌肽的分子工程研究奠定了基础。

微波、超声波技术在固相多肽合成中的应用

本文在对微波、超声波技术进行有机合成的作用机理分析基础上,分别对微波与超声波技术在固相多肽合成中的应用和研究现状进行分析,以促进微波、超声波技术在固相多肽合成中的推广应用。

乳品中常见过敏原特征多肽的筛查及制备应用

β-乳球蛋白是乳品中主要的过敏原物质,乳品过敏主要见于婴幼儿,严重时可能出现生命危险,是影响人体健康安全的主要因素之一。利用蛋白质组学数据库UniProt、酶解模拟软件Skyline、试验验证,对过敏原β-乳球蛋白的特征多肽进行筛查,筛选出1条稳定性强、抗干扰性能优越的多肽IDALNENK,并制备合成了^(13)C、^(15)N标记的IDAL*NENK(^(13)C_(6),^(15)N-Leu)作为β-乳球蛋白的内标物。采用同位素稀释质谱法检测乳品中过敏原时将上述特征多肽作为内标物,可以准确定量乳品中β-乳球蛋白的含量,且灵敏度较高。

棕榈酰四肽-7的固相合成

本文研究一种多肽固相合成棕榈酰四肽-7的方法,在无水环境中,以二氯树脂为原料,进行逐个Fmoc-保护基保护的氨基酸缩合反应,合成了棕榈酰四肽-7。结果表明:产物结构经质谱分析,与标准品对照谱图相符,合成收率95.91%、纯度为99.43%。固相法合成棕榈酰四肽-7操作简单快捷,副产物少,易于分离纯化,可重复性高,适用于大量生产制备。

固相片段法合成利拉鲁肽

目的 研究利拉鲁肽的固相合成。方法 通过汇聚式合成策略,利用固相片段缩合法制备利拉鲁肽。以芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸为原料,分别合成4个全保护多肽片段,依照肽序依次偶联得到全保护利拉鲁肽主链[GLP-1(7-37)],经缩合反应在第20位赖氨酸引入侧链Nα-棕榈酰基-L-谷氨酰基,最后将其从树脂上切割并脱保护得到利拉鲁肽。结果与结论利拉鲁肽粗肽收率为25.65%,纯度为52.35%。采用制备型反相高效液相色谱技术进行分离纯化后,利拉鲁肽纯度为98.42%。该合成工艺反应条件温和、操作简单、合成周期短,是实验室规模下较好的利拉鲁肽制备方法。