VEGFR2 mediated RAS/MAPK signaling pathway to explore the mechanism of Bushen Antai Granule in the treatment of recurrent abortion

Objective:To investigate the effect of Bushen Antai Granule on the mRNA and protein expression of Ras protein/mitogen activated protein kinase mediated by vascular endothelial growth factor receptor 2 with small interference RNA interference.Methods:Method to construct the placenta microvascular endothelial cells,and the preparation of kidney fetus granule drug-containing serum,select the best drug-containing serum concentration,it can be divided into normal group,the serum siRNA-NC normal serum group,drug serum,siRNA normal serum group,siRNA drug serum group,using real-time fluorescent quantitative PCR,Western blotting,immunofluorescence test respectively the RAS/MAPK mRNA and protein expression.Results:Results there was no significant difference in Ras and MAPK mRNA and protein expression between the normal group and the negative control group(P>0.05).The mRNA and protein expressions of Ras and MAPK in the drug serum group were significantly higher than those in the normal serum group(P<0.01).Ras and MAPK mRNA and protein expression were significantly decreased in siRNA1 normal serum group compared with normal serum group(P<0.01).Ras,MAPK mRNA and protein expression in siRNA1 drug serum group were significantly different from that in siRNA1 normal serum group(P<0.01).Conclusion:Conclusion The therapeutic effect of Bushen Antai Granule on recurrent abortion may be realized by upregulation of RAS/MAPK mRNA and protein expression.

补肾安胎冲剂含药血清对复发性流产小鼠胎盘滋养细胞功能、血管内皮生长因子及其受体表达的影响

目的观察补肾安胎冲剂含药血清对复发性流产(RSA)小鼠胎盘滋养细胞功能、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGF-R1、VEGF-R2表达的影响,探讨其治疗RSA的作用机制。方法RSA模型小鼠(CBA/J×DBA/2)和正常妊娠小鼠(CBA/J×BALB/c)分离培养胎盘滋养细胞,将细胞分为正常对照组(正常妊娠小鼠胎盘滋养细胞+空白血清)、模型组(RSA小鼠胎盘滋养细胞+空白血清)和补肾安胎冲剂组(RSA小鼠胎盘滋养细胞+最佳浓度补肾安胎冲剂含药血清),CCK8法检测胎盘滋养细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞周期,RT-qPCR检测细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2 mRNA表达,Western blot检测细胞VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2蛋白表达。结果与正常对照组比较,模型组胎盘滋养细胞增殖活力明显降低(P<0.05),S期细胞比例明显减少,G2/M期细胞比例明显增加(P<0.05),VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,补肾安胎冲剂组胎盘滋养细胞增殖活力明显增加(P<0.05),S期细胞比例明显增加,G2/M期细胞比例明显减少(P<0.05),VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论补肾安胎冲剂含药血清可增强RSA小鼠胎盘滋养细胞增殖活力,上调VEGF及其受体VEGF-R1、VEGF-R2表达,促进母胎界面血管新生,从而提高妊娠成功率。

补肾安胎冲剂联合免疫疗法治疗反复自然流产40例

目的观察补肾安胎冲剂联合免疫疗法治疗反复自然流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)的临床疗效。方法收集封闭抗体低下型RSA患者80例,随机分成综合治疗组、单纯淋巴细胞治疗对照组各40例,对照组采用丈夫淋巴细胞皮下注射主动免疫疗法;综合治疗组在对照组基础上加服补肾安胎冲剂,比较治疗前后两组封闭抗体(微淋巴细胞毒试验镜下细胞死亡率)的变化及妊娠成功率。结果第1个疗程结束后,治疗组与对照组封闭抗体阳转率分别为95.00%、80.00%,妊娠率分别为94.74%、75.00%;治疗组封闭抗体阳转率、妊娠率和淋巴细胞死亡率均显著高于对照组(P<0.05)。结论补肾安胎冲剂联合免疫疗法较单一免疫疗法更能有效刺激RSA患者产生封闭抗体,提高妊娠成功率。

补肾安胎冲剂调控VHL/HIF-1α信号通路改善复发性流产小鼠母胎界面血管生成的实验研究

目的研究补肾安胎冲剂对复发性流产小鼠蜕膜组织中希佩尔-林道抑癌基因(Von Hippel-Lindau,VHL)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的影响,探讨其降低胚胎丢失率的作用机制。方法以CBA/J雌鼠与BALB/C雄鼠合笼复制正常妊娠小鼠模型,以CBA/J雌鼠和DBA/2雄鼠合笼复制复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)小鼠模型,将其随机分为模型组,黄体酮组,补肾安胎冲剂高、中、低剂量组,每组10只。妊娠第1天,正常组与模型组采取蒸馏水灌胃,黄体酮组以26mg/(kg·d)灌胃,补肾安胎冲剂高、中、低剂量组分别按35.1、11.7、3.9g/(kg·d)灌胃。连续干预15d后处死小鼠,收集样本,采用ELISA检测各组小鼠血清VHL、HIF-1α水平,采用荧光定量PCR、免疫组织化学法、Western blot法分别检测各组小鼠蜕膜组织中VHL、HIF-1αmRNA及其蛋白表达水平。结果补肾安胎冲剂显著降低RSA小鼠胚胎丢失率(P<0.05),降低血清和蜕膜组织中VHL水平和VHL mRNA表达水平(P<0.05),升高血清和蜕膜组织中HIF-1α水平和HIF-1αmRNA表达水平(P<0.05),呈现明显的剂量依赖性(P<0.05)。结论补肾安胎冲剂降低RSA小鼠流产率的机制可能与激活VHL/HIF-1α信号通路有关。

基于Tim-3-Gal-9通路探讨补肾安胎冲剂对复发性流产小鼠Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡的影响

目的观察补肾安胎冲剂对复发性流产(RSA)小鼠Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡的影响,从Tim-3-Gal-9通路探讨其作用机制。方法以雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2小鼠合笼饲养建立RSA小鼠模型,将成模小鼠随机分为模型组及补肾安胎冲剂低、高剂量组,每组10只,另设10只与雄性BALB/c小鼠合笼交配的雌性CBA/J小鼠为正常妊娠组。使用相应药物干预15 d,ELISA检测小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-17、IL-23含量,流式细胞术检测小鼠外周血CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)/CD4^(+)和CD4^(+)Foxp3^(+)细胞比例,RT-PCR和Western blot分别检测小鼠蜕膜组织Tim-3、Gal-9 mRNA和蛋白表达。结果与正常妊娠组比较,模型组小鼠流产率、胚胎丢失率显著升高,血清IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-23含量显著增加,IL-4、IL-5、IL-10含量显著减少,CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)/CD4^(+)和CD4^(+)Foxp3^(+)细胞比例显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01),蜕膜组织Tim-3 mRNA和蛋白表达显著升高,Gal-9 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,补肾安胎冲剂低、高剂量组小鼠流产率、胚胎丢失率显著降低(P<0.05,P<0.01),补肾安胎冲剂高剂量组小鼠血清IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-23含量显著减少,IL-4、IL-5、IL-10含量显著增加,CD4^(+)CD25^(+)Foxp3^(+)/CD4^(+)和CD4^(+)Foxp3^(+)细胞比例显著升高,蜕膜组织Tim-3 mRNA和蛋白表达显著降低,Gal-9 mRNA和蛋白表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论补肾安胎冲剂可能通过调控Tim-3-Gal-9通路调节Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡,从而治疗RSA。

补肾安胎冲剂对复发性流产小鼠胎盘滋养细胞miR-187、VEGF、VEGF-R2表达的影响

目的观察补肾安胎冲剂对复发性流产(RSA)小鼠胎盘滋养细胞miR-187、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGF-R2表达的影响,探讨其相关作用机制。方法将雌性CBA/J小鼠与雄性DBA/2小鼠合笼饲养建立RSA小鼠模型,雌性CBA/J小鼠与雄性BALB/c小鼠合笼饲养作为正常妊娠小鼠,分离并培养胎盘滋养细胞,将细胞分为正常对照组(正常妊娠小鼠胎盘滋养细胞+空白血清)、模型组(RSA小鼠胎盘滋养细胞+空白血清)、补肾安胎冲剂组(RSA小鼠胎盘滋养细胞+20%含药血清)、miR-187 inhibitor NC组(RSA小鼠胎盘滋养细胞转染空白miR-187 inhibitor+空白血清)、miR-187 inhibitor组(RSA小鼠胎盘滋养细胞转染miR-187 inhibitor+空白血清)、联合组(RSA小鼠胎盘滋养细胞转染miR-187 inhibitor+20%含药血清)。RT-qPCR检测miR-187、VEGF、VEGF-R2 mRNA表达,Western blot检测VEGF、VEGF-R2蛋白表达,双荧光素酶实验检测miR-187和VEGF靶向关系,采用Spearman法分析miR-187与VEGF、VEGF-R2 mRNA表达量的相关性。结果与正常对照组比较,模型组细胞miR-187表达显著升高,VEGF、VEGF-R2 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组比较,补肾安胎冲剂组细胞miR-187表达显著降低,VEGF、VEGF-R2 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05);与miR-187 inhibitor NC组比较,miR-187 inhibitor组细胞miR-187表达显著降低,VEGF、VEGF-R2 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05);与补肾安胎冲剂组及miR-187 inhibitor组比较,联合组细胞miR-187表达显著降低,VEGF、VEGF-R2 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05)。双荧光素酶实验结果显示,miR-187能够与VEGF靶向结合。Spearman相关性分析显示,miR-187与VEGF、VEGF-R2 mRNA表达呈负相关。结论补肾安胎冲剂可通过下调miR-187活性,靶向上调VEGF、VEGF-R2表达,介导血管新生,促进母胎界面血管重构,从而对RSA发挥治疗作用。

基于VEGFR2介导的Ras/MAPK信号通路探讨补肾安胎冲剂治疗复发性流产的作用机制

目的:探讨补肾安胎冲剂对小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰的血管内皮生长因子受体2介导的Ras蛋白(rat sarcoma protein,Ras)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)mRNA及蛋白表达的影响。方法:构建胎盘微血管内皮细胞,并制备补肾安胎冲剂含药血清,筛选出最佳含药血清浓度,将其分为正常血清组、siRNA-NC正常血清组、药物血清组、siRNA正常血清组、siRNA药物血清组,采用实时荧光定量PCR、Western blotting、免疫荧光法分别检测Ras/MAPK mRNA及蛋白表达。结果:正常组和阴性对照组Ras、MAPK mRNA及蛋白的表达无明显差异(P>0.05);药物血清组细胞Ras、MAPK mRNA及蛋白的表达明显高于正常血清组(P<0.01);siRNA1正常血清组较正常血清组相比Ras、MAPK mRNA及蛋白的表达明显下降(P<0.01);siRNA1药物血清组与siRNA1正常血清组Ras、MAPK mRNA及蛋白的表达相比有显著差异(P<0.01)。结论:补肾安胎冲剂对于复发性流产的治疗作用可能是通过上调Ras/MAPK mRNA及蛋白表达实现的。

补肾安胎颗粒的质量标准研究

目的:建立补肾安胎颗粒的质量控制方法,为其质量标准的拟定提供参考。方法:采用薄层色谱(TLC)法对补肾安胎颗粒中的枸杞子、川续断皂苷、芍药苷、淫羊藿苷和甘草苷进行定性鉴别;采用高效液相色谱(HPLC)法对补肾安胎颗粒中的芍药苷进行定量分析。结果:TLC鉴别表明,对照药材和对照品图谱与样品图谱相应位置上均显现出相同颜色的特征斑点,且阴性对照无干扰。芍药苷在0.04896~0.48960 mg/mL内呈良好的线性关系(r=0.9994),测得平均回收率为100.04%,RSD为0.87%(n=6)。结论:TLC法专属性强、斑点清晰,阴性对照无干扰;芍药苷含量的HPLC法,准确性好、灵敏度高。可以作为补肾安胎颗粒的质量控制方法之一。

补肾安胎冲剂治疗复发性流产的潜在分子机制

目的:基于前期研究,采用网络药理学联合分子对接技术探索补肾安胎冲剂治疗复发性流产的有效成分及作用机制。方法:通过TCMSP数据库筛选出各药物活性成分,利用Pubchem、SwissTarget Prediction数据库预测各药活性成分的潜在靶点,通过Genecards、OMIM、TTD、GeneBank、PharmGkb等数据库获取RSA相关靶点,将药物与疾病相关靶点交集获取共同靶点。然后通过STRING数据库构建PPI网络,运用Cytoscape 3.8.2构建中药复方网络,并筛选补肾安胎冲剂治疗RSA的核心靶点,再运用DAVID数据库、R语言对所得到的核心靶点进行GO功能富集及KEGG通路富集分析,最后采用分子对接技术对关键靶点、相应活性成分进行分子对接验证。结果:通过网络分析可知,补肾安胎冲剂中的11种中药共包含了110个活性成分,涉及139个靶标,与RSA共同靶标基因有102个,GO功能富集分析得到条目1942条(P<0.05),其中BP条目1762个,CC条目32个,MF条目148个,KEGG通路富集分析共得到157条信号通路(P<0.05),主要有PI3K-AKT信号通路、AGE-RAGE信号通路、p53信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、内分泌抵抗等;分子对接结果表明筛选出的关键靶点受体蛋白与活性成分具有较好的结合稳定性。结论:补肾安胎冲剂通过多组分、多靶点和多途径的方式对RSA产生治疗作用。

补肾安胎冲剂含药血清对大鼠骨髓来源内皮祖细胞增殖、迁移能力的影响

目的观察不同浓度补肾安胎冲剂含药血清对大鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)增殖及迁移能力的影响。方法选取SPF级3~4周龄雌性SD大鼠,采用密度梯度离心法分离单个骨髓核细胞,收集培养7 d的细胞,分别通过双荧光染色法、免疫荧光法及流式细胞仪动态检测EPCs表面标志物等方法,鉴定分离培养的细胞为大鼠骨髓来源EPCs。制备补肾安胎冲剂含药血清,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度(5%,10%,15%,20%)补肾安胎冲剂含药血清作用不同时间(24,48,72 h)的大鼠骨髓来源EPCs的增殖率;通过Transwell法检测大鼠骨髓来源EPCs的迁移能力。结果经双荧光染色法鉴定,所培养细胞乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AC-LDL)和异硫氰酸荧光素荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)双荧光染色呈双阳性;免疫荧光染色后,EPCs特异性表面抗原人白细胞分化抗原CD34、CD133及血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)染色均呈阳性,其阳性细胞率分别为94.7%,93.8%,98.8%,提示培养的细胞为EPCs。MTT比色法检测结果显示,经不同浓度的补肾安胎冲剂含药血清干预培养后,5%,10%,15%浓度含药血清可促进大鼠骨髓源性EPCs增殖,其中10%浓度含药血清作用48 h的细胞增殖率最高(50.34%);Transwell法检测结果显示,每高倍镜视野下对照组及含药血清组(10%)EPCs平均迁移细胞数分别为(51.0±7.94),(105.5±15.22)个,与对照组比较,含药血清组(10%)EPCs的迁移能力明显增强(P<0.01)。结论补肾安胎冲剂含药血清可增强大鼠骨髓源性EPCs的增殖及迁移能力,且10%浓度作用48 h EPCs的增殖率最高。

补肾安胎冲剂调节TGF-β1及其下游PI3K/AKT信号通路改善复发性流产小鼠母胎界面血管生成

目的研究补肾安胎冲剂对复发性流产(RSA)小鼠蜕膜组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)相关蛋白的影响,探讨其降低胚胎流产率的作用机制。方法以CBA/J×Balb/c小鼠合笼建立正常妊娠小鼠模型。以DBA/2×CBA小鼠合笼建立RSA小鼠模型,将其随机分为模型组,黄体酮组,补肾安胎冲剂高、中、低剂量组。每组每日以相应药物灌胃,连续干预15 d后处死小鼠,收集样本,肉眼观察各组孕鼠胚胎丢失情况;HE染色法观察每组小鼠蜕膜组织病理形态学改变;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组小鼠血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)、TGF-β1、PI3K、AKT的含量;采用免疫组化法及蛋白质印迹(Western blot)法检测各组小鼠蜕膜组织中TGF-β1、PI3K、AKT的蛋白表达。结果与正常组相比,模型组小鼠胚胎丢失率升高(P<0.01),血清中E2、P、TGF-β1、PI3K、AKT的含量均下降(P<0.01),蜕膜组织中TGF-β1、PI3K、AKT蛋白表达均下降(P<0.01)。与模型组相比,经药物干预后的小鼠胚胎丢失率均降低(P<0.01),血清中E2、P、TGF-β1、PI3K、AKT的含量均增加(P<0.01),蜕膜组织中TGF-β1、PI3K、AKT的蛋白表达水平均升高(P<0.01),其中补肾安胎冲剂高剂量组更为显著。结论补肾安胎冲剂能降低RSA小鼠流产率,其机制可能是通过上调TGF-β1/PI3K/AKT信号通路,促进RSA小鼠母胎界面血管生成,从而发挥保胎作用。

补肾安胎冲剂对复发性流产小鼠蜕膜组织RAS、MAPK蛋白表达的影响

目的探讨补肾安胎冲剂对复发性流产模型小鼠蜕膜组织RAS、MAPK蛋白表达的影响。方法随机将60只复发性流产小鼠分为正常组,模型组,西药黄体酮组,补肾安胎冲剂低、中、高剂量组,每组10只,从妊娠第1天开始灌胃给药,干预15d。处死小鼠,留取样本。采用免疫组化法、Western blotting技术检测各组小鼠蜕膜组织RAS、MAPK蛋白的表达水平。结果与正常组相比,模型组蜕膜组织RAS、MAPK表达降低(P<0.05);与模型组相比,西药黄体酮组、补肾安胎冲剂低、中、高剂量组蜕膜组织RAS、MAPK表达显著升高(P<0.01);与西药组、补肾安胎冲剂低、中剂量组相比,补肾安胎冲剂高剂量组蜕膜RAS、MAPK表达显著升高(P<0.01)。结论补肾安胎冲剂具有安胎作用,其机制可能与上调复发性流产小鼠蜕膜组织RAS、MAPK蛋白表达水平有关。

补肾安胎冲剂对复发性流产小鼠蜕膜组织VEGF及VEGFR2蛋白表达的影响

目的:探讨补肾安胎冲剂对复发性流产模型小鼠蜕膜组织血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)蛋白表达的影响。方法:采用CBA/J×BALB/c小鼠复制正常妊娠模型;采用DBA/2×CBA小鼠复制复发性流产(RSA)模型。造模后小鼠分为正常组、模型组、西药(黄体酮)组及补肾安胎冲剂低、中、高剂量组,每组10只,从妊娠第1天开始灌胃给药,干预15 d。处死小鼠,留取样本。采用免疫组化法、Western blot技术检测各组小鼠蜕膜组织VEGF、VEGFR2蛋白的表达水平。结果:与正常组比较,模型组蜕膜组织VEGF、VEGFR2表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,西药组及补肾安胎冲剂低、中、高剂量组小鼠蜕膜组织VEGF、VEGFR2表达显著升高(P<0.01)。结论:补肾安胎冲剂具有安胎作用,其机制可能与上调复发性流产小鼠蜕膜组织VEGF、VEGFR2蛋白表达水平有关。

补肾安胎冲剂对肾虚流产大鼠母胎界面IGF-1及VEGF表达的影响

目的:探讨补肾安胎冲剂对肾虚流产大鼠母胎界面VEGF、IGF-1表达的影响。方法:复制肾虚流产模型,随机分为模型组、中药组、西药组,将正常妊娠大鼠作为正常妊娠组。正常妊娠组和模型组灌服蒸馏水,中药组灌服补肾安胎冲剂(5.0 g·kg-1·d-1),西药组灌服黄体酮(50 mg·kg-1·d-1)。末次给药24 h后,剖视子宫观察流产率;切取子宫组织(含蜕膜组织),免疫组化SABC法检测大鼠蜕膜VEGF、IGF-1蛋白表达。结果:模型组大鼠流产率明显升高(P<0.01),蜕膜VEGF、IGF-1表达明显降低(P<0.01);VEGF与IGF-1变化呈正相关(r=0.778,P<0.05);中药组和西药组大鼠流产率显著降低(P<0.01);中药组VEGF、IGF-1表达显著升高(P<0.01)。结论:补肾安胎冲剂可能通过升高肾虚流产大鼠蜕膜IGF-1、VEGF的表达,参与胎盘血管新生过程,促进胚胎发育,提高妊娠成功率。