补肾开窍方通过调控ERK1/2和铁死亡治疗糖尿病合并缺血性卒中机制研究

目的:采用网络药理学和分子对接、动物实验探讨并验证补肾开窍方治疗糖尿病合并缺血性卒中的分子作用机制。方法:雄性SD大鼠48只,随机分为假手术组12只和造模组36只,造模组大鼠第1天和第4天分别腹腔注射1%链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,50 mg·kg^(-1))各1次,第14天采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法建立糖尿病合并缺血性卒中模型大鼠。将造模组大鼠随机分为糖尿病MCAO模型组(STZ+MCAO)、补肾开窍方高剂量组(18.7 g·kg^(-1))、补肾开窍方低剂量组(9.4 g·kg^(-1)),实验第7天糖尿病造模成功后开始给予中药,每天灌胃1次,连续8 d。TTC法测量大鼠脑缺血体积;Garcia JH法检测大鼠神经功能缺损程度;干湿重法测定脑含水量。明确补肾开窍方治疗糖尿病合并缺血性卒中的疗效。随后从TCMSP、HERB、GeneCards、OMIM、Disgenet数据库筛选补肾开窍方的活性成分和靶点,采用Cytoscape 3.8.0软件构建成分-靶点-通路关联网络;利用STRING数据库进行蛋白质互作(protein-protein interaction,PPI)网络分析,Metascape数据库进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析与京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析;采用分子对接软件对活性成分与核心靶点进行验证。随后采用免疫荧光染色法检测大鼠缺血侧皮层中p-ERK1/2表达,Western blot法检测p-ERK1/2、ERK1/2、GPX4、SLC7A11的蛋白表达。结果:动物实验结果显示,与假手术组相比,STZ+MCAO组大鼠血糖显著升高(P<0.01),神经功能评分显著降低(P<0.01),脑缺血体积和脑含水量显著增加(P<0.01),补肾开窍方高、低剂量组可逆转上述变化。网络药理学筛选得到活性成分436种,预测得到补肾开窍方的潜在靶点219个,PPI分析表明RELA、STAT3、ERK1、ERK2、JUN等为核心靶点。GO和KEGG分析显示补肾开窍方的作用机制可能与MAPK信号通路密切相关。分子对接结果显示,ERK1、ERK2与活性成分结合较好。验证实验结果显示,与假手术组相比,STZ+MCAO组大鼠缺血侧皮层中p-ERK1/2表达显著上升(P<0.01),GPX4、SLC7A11蛋白表达显著下降(P<0.01);与STZ+MCAO组相比,补肾开窍方高、低剂量组p-ERK1/2表达显著下降(P<0.01),GPX4、SLC7A11蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01)。结论:补肾开窍方对糖尿病合并缺血性卒中模型大鼠具有神经保护作用,其作用机制可能与调控ERK1/2和抑制铁死亡密切相关。