基于miR-335/ROCK2轴探讨补肾启智方对OGD/R损伤HT22细胞焦亡与应激颗粒的影响

目的:探讨补肾启智方通过调控微小RNA-335(microRNA-335,miR-335)靶向Rho家族相关蛋白激酶2(Rho associated protein kinase 2,ROCK2)蛋白,对氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤HT22细胞焦亡与应激颗粒的影响。方法:取对数生长期的HT22细胞,随机分为空白组、模型组、补肾启智方组、miR-335抑制组、空病毒对照组、补肾启智方+miR-335抑制组。除空白组外,其余各组细胞均建立OGD/R损伤模型。采用CCK-8法检测细胞存活率,qRT-PCR法检测细胞miR-335 mRNA表达水平,Western blot检测细胞ROCK2、T细胞胞内抗原1(T cell intracellular antigen 1,TIA1)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(c-Caspase-1)、消皮素D-N(gasdermin D-N,GSDMD-N)蛋白表达水平,ELISA法检测细胞上清液白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)水平。结果:与空白组比较,模型组细胞存活率、miR-335 mRNA水平降低(P<0.05)。与模型组比较,补肾启智方组细胞存活率、miR-335 mRNA水平升高,miR-335抑制组细胞存活率、miR-335 mRNA水平降低(P<0.01)。与空病毒对照组比较,miR-335抑制组细胞存活率、miR-335 mRNA水平降低(P<0.01)。与miR-335抑制组比较,补肾启智方+miR-335抑制组细胞存活率、miR-335 mRNA水平升高(P<0.01)。与空白组比较,模型组细胞ROCK2、NLRP3、ASC、c-Caspase-1、GSDMD-N蛋白表达水平升高,TIA1蛋白表达水平降低(P<0.01)。与模型组比较,补肾启智方组细胞ROCK2、NLRP3、ASC、c-Caspase-1、GSDMD-N蛋白表达水平降低,TIA1蛋白表达水平升高,而miR-335抑制组细胞上述蛋白的表达趋势与之相反(P<0.05)。与空病毒对照组比较,miR-335抑制组细胞ROCK2、NLRP3、ASC、c-Caspase-1、GSDMD-N蛋白表达水平升高,TIA1蛋白表达水平降低(P<0.05);相较于miR-335抑制组,补肾启智方+miR-335抑制组细胞上述蛋白的表达趋势与之相反(P<0.01)。与空白组比较,模型组细胞IL-1β、IL-18水平升高(P<0.01)。与模型组比较,补肾启智方组细胞IL-1β、IL-18水平降低(P<0.01),miR-335抑制组细胞则与之相反(P<0.05)。与空病毒对照组比较,miR-335抑制组细胞IL-1β、IL-18水平升高(P<0.05);相较于miR-335抑制组,补肾启智方+miR-335抑制组细胞上述因子的表达趋势与之相反(P<0.01)。结论:补肾启智方可能通过调控miR-335/ROCK2活性,促进应激颗粒形成,抑制炎症反应以及NLRP3介导的细胞焦亡,从而发挥神经保护作用。

基于网络药理学和动物实验探讨补肾启智方对血管性痴呆铁死亡的作用机制

目的:采用网络药理学方法和分子对接技术并结合体内实验,分析并验证补肾启智方调控海马神经元铁死亡改善血管性痴呆(vascular dementia,VD)认知功能的作用机制。方法:在TCMSP数据库、BATMAN-TCM数据库、ETCM数据库筛选补肾启智方的活性成分及其作用靶点;在GeneCards数据库、OMIM数据库、DisGeNET数据库筛选血管性痴呆的潜在靶点;在FerrDB数据库筛选铁死亡的相关靶点,以上所有靶点均经Uniprot数据库规范,并在微生信-免费在线绘制韦恩图——Venn Diagrams网站获得三者的交集靶点。采用Cytoscape 3.9.1软件绘制“补肾启智方药物-活性成分-潜在靶点”网络、“补肾启智方-血管性痴呆-铁死亡靶点”的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,并进行拓扑学分析以获得核心成分与核心靶点;在DAVID数据库进行交集靶点的基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。采用AutoDock 4软件进行分子对接,并利用PyMol 2.5软件对分子对接结果进行可视化分析。通过动物实验验证关键靶点及信号通路。将32只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、补肾启智方高剂量组(14.4 g·kg^(-1))、补肾启智方低剂量组(3.6 g·kg^(-1)),每组8只。除假手术组外,其余大鼠采用双侧颈总动脉永久结扎(2-vessel occlusion,2-VO)法建立血管性痴呆模型。采用Morris水迷宫实验评估大鼠的空间学习与记忆能力;Western blot法检测大鼠海马组织中缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、细胞溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的蛋白表达;生化法检测大鼠海马组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平。结果:筛选得到补肾启智方调控海马神经元铁死亡治疗VD的活性成分40种,有效靶点30个,核心成分是槲皮素、茉莉酮、马兜铃酮,核心靶点是肿瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,MTOR)、HIF-1α;GO功能富集分析结果显示,补肾启智方可能通过改善细胞对过氧化氢、缺氧、氧化应激的反应及促进血管生成等方面治疗VD,KEGG通路富集分析表明,其可能通过调控缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信号通路、细胞衰老、活性氧、叉头盒蛋白O(forkhead box protein O,FoxO)信号通路、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路等治疗VD。经补肾启智方干预后,VD大鼠的空间学习与记忆能力得到改善,海马组织MDA表达降低(P<0.01)、GSH水平升高(P<0.01),HIF-1α与铁死亡核心调控蛋白SLC7A11和GPX4蛋白表达水平显著升高(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。结论:补肾启智方可通过多成分、多靶点改善VD认知功能,其关键机制可能与激活HIF-1α/SLC7A11/GPX4信号通路、抑制海马神经元铁死亡相关。

补肾启智方调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路对缺血性卒中大鼠认知功能的影响

目的 研究补肾启智方通过调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路改善缺血性卒中大鼠认知功能的作用机制。方法 采用大脑中动脉栓塞法建立缺血性卒中大鼠模型。将雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补肾启智方低剂量组(3.6 g/kg)、补肾启智方高剂量组(14.4 g/kg),每组9只,连续灌胃14 d。采用Garcia JH法评价大鼠神经功能缺损程度;Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习和记忆能力;Western blotting法检测大鼠缺血侧海马组织中Keap1、Nrf2及血红素氧合酶1(HO-1)的蛋白表达水平;TBA法、WST-1法、微板法分别检测大鼠缺血侧海马组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力及谷胱甘肽(GSH)含量;酶联免疫吸附测定法检测大鼠缺血侧海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-18(IL-18)、干扰素诱导蛋白10(CXCL10)水平。结果 与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分降低(P<0.01),逃避潜伏期时间延长(P<0.01),目标象限停留时间及穿越平台次数均减少(P<0.05,P<0.01),海马组织中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达水平、MDA含量以及TNF-α、IL-18、CXCL10水平均升高(P<0.05,P<0.01),SOD活力、GSH含量降低(P<0.01)。与模型组比较,补肾启智方高、低剂量组大鼠的神经功能评分升高(P<0.01),其中补肾启智方高剂量组大鼠逃避潜伏期时间缩短(P<0.01),目标象限停留时间及穿越平台次数均增多(P<0.05,P<0.01),补肾启智方低剂量组大鼠目标象限停留时间增多(P<0.05);补肾启智方高、低剂量组海马组织中Keap1蛋白表达、MDA含量及TNF-α、IL-18、CXCL10水平均降低(P<0.05,P<0.01),Nrf2蛋白表达水平及SOD活力、GSH含量均升高(P<0.05,P<0.01),补肾启智方高剂量组HO-1蛋白表达水平升高(P<0.05)。与补肾启智方低剂量组比较,补肾启智方高剂量组大鼠神经功能评分升高(P<0.01),海马组织中Keap1蛋白表达水平、MDA含量及TNF-α、IL-18水平降低(P<0.05,P<0.01),SOD活力及GSH含量升高(P<0.05)。结论 补肾启智方改善缺血性卒中大鼠神经功能缺损及认知功能损伤的作用机制,可能与激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路、抑制海马氧化应激及炎症反应有关。