补肾活血方促进骨髓间充质干细胞的成骨及其防治大鼠骨质疏松症机制研究

目的 研究表明微核糖核酸(microRNA,MiRNA)和Kruppel样因子10(Kruppel-like factor10, KLF10)调控骨质疏松症的进程。研究旨在探讨miR-26b/KLF10信号调控骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)分化的机制。方法 流失鉴定分离的大鼠BMSCs,不同剂量的补肾活血方处理BMSCs,检测其^([1-2])增殖能力,碱性磷酸酶活性和茜素红染色检测BMSCs的成骨分化潜能。qPCR检测不同剂量的补肾活血方处理BMSCs后,miR-26b和KLF10的表达水平。mirtarBase数据库检测KLF10 mRNA的3’非翻译区(untranslated regions, 3'UTR)上是否有miR-26b的结合位点,双荧光素酶报告实验检测miR-26b对KLF10启动子活性的影响。qPCR检测miR-26b/KLF10信号对BMSCs增殖和成骨分化标志物的表达的影响。Western blot检查Wnt/β-catenin信号是否被激活。结果 流式分析显示分离的原代细胞大部分是BMSCs。补肾活血方显著促进骨髓间充质干细胞的增殖,补肾活血方显著提高了BMSCs中碱性磷酸酶的水平和成骨分化的潜能。补肾活血方促进BMSCs中miR-26b和KLF10的表达。在KLF10 mRNA的3’UTR上有miR-26b的结合位点。在BMSCs中,miR-26b抑制KLF10的3’UTR荧光素酶活性。此外,miR-26b也抑制了KLF10的表达水平。CCK8(Cell Counting Kit-8)显示KLF10促进BMSCs增殖,qPCR显示miR-26b显著抑制成骨分化标志物的表达。而KLF10能够逆转miR-26b的抑制效应,提示miR-26b/KLF10信号介导了补肾活血方在BMSCs增殖和成骨分化中的效应,且补肾活血方通过激活Wnt/β-Catenin信号通路促进成骨。结论 补肾活血方促进BMSCs的成骨由miR-26b/KLF10/Wnt/β-Catenin信号轴调控。

补肾活血复方调控Wnt通路抑制心力衰竭心肌损伤及细胞凋亡的机制研究

目的 研究补肾活血复方通过抑制Wnt信号通路(Wingless)抑制心力衰竭大鼠心肌损伤及细胞凋亡的分子机制。方法 将45只斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley, SD)大鼠随机分为假手术组、模型组、补肾活血复方组及赖诺普利组。采用结扎冠状动脉配合力竭式游泳构建心力衰竭模型。造模成功后按照实验分组利用补肾活血复方或赖诺普利给予大鼠持续灌胃4周。治疗结束后,采用彩色超声多普勒心动图评价大鼠心功能,称取体质量(body weight, BM)及左心室湿质量(left ventricular wet mass, LVM),计算左心室质量指数(left ventricular mass index, LVMI),苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色检测心肌病理组织学损伤,蛋白质印迹(Western blot)检测BCL2凋亡调节器(BCL2 apoptosis regulator, Bcl-2)、BCL2相关X,凋亡调节器(BCL2 associated X,apoptosis regulator, Bax)、活化半胱天冬酶3(cleaved-caspase-3)、Wnt家族成员3A(wnt family member 3A,Wnt3a)、β-连环蛋白(β-catenin)蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测Bcl-2、Bax、半胱天冬酶3(Caspase-3)、Wnt3a、β-catenin mRNA表达。结果 与假手术组比,模型组的左心室舒张末内径(left ventricular end diastolic diameter, LVEDD)及左心室收缩末内径(left ventricular end systolic diameter, LVESD)、LVMI、Bax、Wnt3a、β-catenin蛋白及mRNA,cleaved-caspase-3蛋白,Caspase-3 mRNA表达均显著上调,左室短轴缩短率(left ventricular short axis shortening rate, LVFS)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、Bcl-2蛋白及mRNA,cleaved-caspase-3蛋白,Caspase-3 mRNA表达均显著下调,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比,补肾活血复方组及赖诺普利组LVEDD、LVESD、LVMI、Bax、cleaved-caspase-3、Wnt3a、β-catenin蛋白及mRNA表达显著下调,LVFS、LVEF、Bcl-2蛋白及mRNA表达显著上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。假手术组心肌细胞形态正常,肌纤维排列整齐,结构清晰;模型组心肌纤维紊乱,存在炎性细胞浸润;赖诺普利组及补肾活血复方组心肌损伤及炎症浸润明显改善。结论 补肾活血复方可通过抑制Wnt信号通路抑制心力衰竭大鼠心肌损伤及细胞凋亡。

不明原因复发性流产患者分泌晚期外周血中自噬水平对蜕膜化调控作用及补肾活血方干预机制

目的探索分泌晚期外周血中自噬水平的异常对不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)患者蜕膜化的影响及补肾活血方的作用机制。方法收集至少有过一次成功妊娠且无自然流产史的女性(对照组)40例和肾虚血瘀型URSA患者(观察组)40例。观察组在入组后的3个月内严格按照实验要求服用中药汤剂补肾活血方。运用ELISA法检测两组分泌晚期血清中人胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor-binding protein-1,IGFBP-1)和催乳素(prolactin,PRL)水平,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关基因6(Beclin 1)、泛素样结合蛋白(p62)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达。结果(1)观察组中自噬水平、蜕膜化水平较对照组女性明显降低。(2)治疗后观察组自噬水平、蜕膜化水平较入组时有明显改善。结论(1)URSA患者分泌晚期外周血中自噬水平降低影响蜕膜化水平,进而增加流产发生的风险。(2)补肾活血方可显著改善肾虚血瘀型URSA患者分泌晚期外周血中自噬水平,进而改善蜕膜化状态,为正常妊娠奠定基础。

补肾活血方配合膝寸劲伸缩锻炼治疗中重度膝骨关节炎的疗效及对相关炎症因子的影响

目的探讨补肾活血方配合膝寸劲伸缩锻炼治疗中重度膝骨关节炎(KOA)的效果及对血清白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。方法50例中重度KOA患者随机分为对照组与治疗组(各25例),对照组用艾瑞昔布、盐酸氨基葡萄糖及股四头肌收缩锻炼治疗,治疗组用补肾活血方与膝关节寸劲伸缩锻炼治疗。观察两组患者治疗前、治疗后1周与3周时膝Lysholm关节功能评分、血清IL-6及TNF-α的变化,并随访患者0.5~1年内急性疼痛的复发情况。结果治疗前,两组患者膝Lysholm评分、血清IL-6及TNF-α比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗1周后,两组患者膝Lysholm评分、血清IL-6与TNF-α水平与各组治疗前比较均有统计学意义(均P<0.01),且治疗组更优于对照组(均P<0.01)。治疗3周后,两组患者膝Lysholm评分、血清IL-6与TNF-α水平与治疗前、治疗1周后比较均有统计学意义(均P<0.01),且治疗组更优于对照组(P<0.01)。治疗后0.5~1年内,两组患者急性疼痛发作频次无统计学意义。结论补肾活血方配合膝寸劲伸缩锻炼治疗中重度KOA疗效显著,且可快速降低患者血清IL-6与TNF-α表达水平。

补肾养血方防治气态甲醛慢性染毒小鼠卵巢损伤的研究

目的:研究气态甲醛慢性染毒对小鼠卵巢功能的影响,以及补肾养血方对其卵巢毒性的防治作用。方法:将30只性成熟SPF级雌性昆明小鼠随机分为对照组、染毒组和治疗组,对照组给予吸入经过滤的新鲜空气,染毒组和治疗组采用气态甲醛动态吸入式染毒,6 h/d,连续14 d,同时治疗组给予补肾养血方灌胃,对照组和染毒组给予等量生理盐水灌胃。观察小鼠一般状态及动情周期。实验结束后处死小鼠,测定小鼠血清性激素水平,计算卵巢脏器系数,观察卵巢病理形态学变化,并计数各级卵泡数,检测卵巢局部相关基因的表达水平。结果:染毒组小鼠一般状态差,动情周期延长,小鼠血清E2水平降低,FSH、LH水平升高,卵巢脏器系数降低,卵巢内生长卵泡减少,闭锁卵泡增多;卵巢Foxl2、FSHR mRNA表达水平升高,Esr2、Pgr mRNA表达水平降低,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组小鼠一般状态好转,动情周期缩短;血清E2水平升高,FSH水平降低,卵巢脏器系数升高,卵巢内生长卵泡增加,闭锁卵泡减少,卵巢Foxl2、FSHR mRNA表达降低,Esr2 mRNA表达上升,与染毒组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Pgr mRNA表达有上升趋势,但与染毒组比较差异无统计学意义(P>0.0)。结论:气态甲醛慢性染毒可影响小鼠卵巢功能,补肾养血方可防治甲醛对卵巢的损害作用,改善卵巢功能。

补肾活血方“导法”调控5/12-LOX/LXA4/FPR2改善子宫内膜容受性不良大鼠的助孕机制

目的观察补肾活血方“导法”调控肾虚血瘀子宫内膜容受性不良大鼠种植窗期LXA4相关信号轴的助孕机制。方法通过分子对接预测补肾活血方有效组分与脂氧素A4(LipoxinA4,LXA4)合成酶及受体的结合程度;通过羟基脲灌胃+肾上腺素皮下注射构建肾虚血瘀内膜容受性不良复合模型大鼠;随机分为模型组、空白组、补肾活血导法低、中、高组、阳性组6组;各组造模同时予以相应干预方法,连续10 d,并于动情期按照2∶1雌雄合笼,次日晨检发现阴栓脱落或阴道涂片发现阴栓记为1.0 dpc,于6.0 dpc麻醉处死剖出子宫组织;记录每组子宫内膜、胞饮突形态并评分,观察子宫内膜上胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor-binding protein-1,IGFBP-1)、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)蛋白分布表达和同源盒基因A10(HomeoboxA10,HOXA10)mRNA表达,测定子宫组织匀浆中炎症介质LXA4、合成酶5/12/15-脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)、受体甲酰肽受体2(Formyl Peptide Receptor-2,FPR2)和IGFBP-1、VEGF的蛋白含量。结果与空白组相比,模型组子宫内膜被覆上皮菲薄、腺体较少,与模型组对比;补肾活血方导法低、中、高剂量组、阳性组可下调肾虚血瘀PER模型大鼠种植窗期5-LOX、12-LOX、LXA4及FPR2的表达(P<0.05),提高了子宫内膜容受性标记物IGFBP-1、VEGF蛋白和HOXA10 mRNA表达。结论补肾活血方导法通过调控大鼠种植窗期子宫5/12-LOX/LXA4/FPR2信号通路纠正炎性微环境的平衡,进而改善子宫内膜容受性,促进胚-膜交互提高种植及妊娠成功率。

活血补肾方联合左氧氟沙星治疗湿热瘀结型慢性盆腔炎效果分析

目的分析活血补肾方联合左氧氟沙星治疗湿热瘀结型慢性盆腔炎效果。方法选取医院2017年4月—2019年5月收治的湿热瘀结型慢性盆腔炎患者108例,采用随机数字法分为两组。对照组给予左氧氟沙星治疗,观察组给予活血补肾方联合左氧氟沙星治疗,分析两组患者治疗后的临床效果。结果两组治疗前中医证候积分组间比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。观察组治疗后主证(小腹胀痛、腰骶胀痛、带下量多)积分、次证(神疲乏力、口腻或纳呆、小便黄、大便干燥)积分低于对照组(P<0.05)。两组治疗前C反应蛋白(CRP)、血红素氧和酶-1(HO-1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)水平组间比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。观察组治疗后CRP、HO-1、GM-CSF水平低于对照组(P<0.05)。两组治疗前盆腔炎性包块直径组间比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。观察组治疗后盆腔炎性包块直径(1.24±0.42)cm低于对照组(P<0.05)。观察组不良反应率(7.41%,4/54)与对照组(5.56%,3/54)比较,差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论活血补肾方联合左氧氟沙星治疗湿热瘀结型慢性盆腔炎可调节CRP、HO-1、GM-CSF的表达水平,缩小盆腔炎性包块直径,改善症状积分,且不增加不良反应。

基于STAT3通路探讨补肾活血方抑制骨细胞凋亡

目的探讨补肾活血方通过信号转导与转录激活子3(STAT3)通路抑制骨细胞的凋亡对骨质疏松的治疗作用。方法选取SPF级健康雌性C57BL/6小鼠75只,随机分为正常对照组11只及造模组64只。造模组采用去势法建立骨质疏松症模型,正常对照组仅暴露双侧卵巢而不切除。将造模成功的小鼠随机分为模型组、补肾活血方低、中、高剂量组及阳性对照组,各12只。模型组和正常对照组分别灌胃给予蒸馏水5 mL·kg^(-1),1次/d;补肾活血方低、中、高剂量组分别灌胃给予1.79、3.57、7.14 g·mL^(-1)补肾活血方药液5 mL·kg^(-1),1次/d;阳性对照组灌胃给予0.14 mg·mL^(-1)尼尔雌醇混悬液5 mL·kg^(-1),1次/d。各组小鼠均治疗12周。检测比较各组骨形态参数,骨细胞凋亡指数(AI),以及骨组织B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Janus激酶2(JAK2)、STAT3表达水平。结果与模型组比较,各组小鼠骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)及骨密度(BMD)值较高,骨组织Bcl-2蛋白表达水平较高,且补肾活血方低剂量组<补肾活血方中剂量组<补肾活血方高剂量组和阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,各组小鼠骨组织AI较低,骨组织Bax蛋白表达水平较低,骨组织JAK2、STAT3表达水平较低,且补肾活血方低剂量组>补肾活血方中剂量组>补肾活血方高剂量组和阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论补肾活血方能剂量依赖性的增加骨质疏松小鼠骨密度,增加骨小梁厚度和数量,抑制骨细胞凋亡,其作用可能与抑制STAT3信号通路,调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达有关。

补肾养血汤联合重组人促红素治疗肾性贫血(气血两虚)随机平行对照研究

[目的]观察补肾养血汤联合重组人促红素治疗肾性贫血(气血两虚)疗效。[方法]使用随机平行对照方法,将42例门诊及住院患者按随机数字表法随机分为两组,优质蛋白、低磷饮食,足够热量,维生素B族、叶酸、琥珀酸亚铁、活性钙等,控制感染、血压及纠正水、电解质酸碱失调。对照组20例重组人促红素6000IU/次,3次/周,皮下注射。治疗组22例补肾养血汤(黄芪30g,党参20g,当归12g,地黄熟30g,黄精、龟板各20g,山药30g,山茱萸10 g,白术炒15g,菟丝子、补骨脂、仙茅、仙灵脾各10g,丹参15g,陈皮8g,砂仁6g),水煎300mL,1剂/d,2次/d;重组人促红素治疗同对照组。连续治疗8周为1疗程。观测临床表现、血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血红蛋白(Hb)、不良反应。治疗1疗程(8周),判定疗效。[结果]治疗组临床痊愈10例,显效6例,有效4例,无效1例,总有效率95.45%;对照组临床痊愈3例,显效5例,有效5例,无效7例,总有效率65.00%;治疗组疗效优于对照组(P<0.05)。Scr,BUN,Hb两组均有改善(P<0.05,P<0.01),治疗组改善优于对照组(P<0.05)。[结论]补肾养血汤联合重组人促红素治疗肾性贫血(气血两虚),疗效满意,无严重不良反应,值得推广。

张晓峰温肾养血调经汤联合西药循期序贯疗法辨治肾虚血亏多囊卵巢综合征不孕

张晓峰教授认为多囊卵巢综合征肾虚血亏、冲任虚寒为本,痰饮、湿浊壅阻胞宫冲任为标,伴痤疮、便秘、带下黄稠等特殊症状,则是个体异质、痰饮、湿浊从阳化热。创立"扶正固本、补肾养血、循期序贯"法,注重病机,强调中西医结合,运用补肾养血调经汤(当归12g,川芎10g,炒白芍、熟地、丹参、鸡血藤各15g,菟丝子20g,仙灵脾15g,紫石英20g,合欢皮、川牛膝各15g,炙甘草6g),注重药物加减、配伍剂量,联合达英35、克罗米芬等治疗,嘱患者掌握"候"、适时交合、夫妻同治及心理疏导,事半功倍,疗效显著。附验案1则。

补肾活血方有效组分及部分化合物的体外抗炎活性研究

目的:观察补肾活血方水提取部位、醇提取部位、总多糖部位以及大黄酸、大黄酚等有效组分与化合物对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及一氧化氮(NO)等炎症介质释放浓度的影响作用,探讨复方治疗骨关节炎的初步机制。方法:选取补肾活血方不同提取分离部位,以及复方水提液中存在的具有潜在治疗骨关节炎活性的大黄酸、大黄酚化合物,采用体外脂多糖(LPS)刺激的RAW264.74小鼠巨噬细胞为模型,利用酶联免疫法(ELISA)测定试药对模型细胞释放TNF-α、IL-6及NO的抑制作用。结果:复方水提取部位与醇提取部位在100μg/ml,以及大黄酚在20μg/ml和100μg/ml对TNF-α的释放具有显著的抑制;复方醇提取部位在100μg/ml,大黄酸在20μg/ml,以及大黄酚在20μg/ml和100μg/ml对IL-6水平具有显著的抑制;复方水提取部位在100μg/ml、醇提取部位在20μg/ml和100μg/ml、大黄酸在20μg/ml,以及大黄酚在20μg/ml和100μg/ml对NO的释放具有显著抑制。结论:补肾活血方的治疗骨关节炎活性可能是通过抑制炎症介质释放,降低TNF-α、IL-6、NO等含量发挥作用,这对验证复方药效活性,探究效应物质基础具有重要意义。

补肾活血方对慢性心力衰竭大鼠心功能及肾组织水通道蛋白2的影响

目的探讨补肾活血方治疗慢性心力衰竭的可能作用机制。方法 60只SD大鼠随机选出15只为假手术组,其余45只采用冠状动脉结扎及术后给予减食和力竭式游泳建立慢性心力衰竭大鼠模型,造模成功后随机分为模型组、西药组、中药组。假手术组和模型组大鼠每日给予蒸馏水灌胃2次,每次3 ml;西药组给予卡托普利片12. 5 mg/(kg·d)灌胃;中药组给予补肾活血方9. 2 g/(kg·d)灌胃,持续给药4周。实验期间观察各组大鼠皮毛、活动、体重、喘鸣音等一般情况,心脏彩色超声检测大鼠舒张末期左心室内径(LVEDD)、收缩末期左心室内径(LVESD),并计算左心室射血分数(EF)及左心室短轴缩短分数(FS),测定大鼠血清脑利钠肽(BNP)水平和大鼠肾脏组织中水通道蛋白2 (AQP2)表达。结果模型组大鼠毛色晦暗,甚至脱毛,活动性差,体重减轻,部分大鼠有咳嗽、喘促症状;而西药组、中药组大鼠各症状均有所改善。与假手术组比较,模型组大鼠LVEDD、LVESD升高,EF、FS降低,血清BNP水平和肾组织AQP2表达升高(P <0. 05)。与模型组比较,中药组及西药组大鼠LVEDD、LVESD降低,EF、FS升高,血清BNP水平及肾组织AQP2表达降低(P <0. 05);西药组与中药组各指标比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论补肾活血方可能通过降低慢性心力衰竭大鼠血清BNP,下调肾组织AQP2表达,从而改善心功能。

补肾活血方对激素性股骨头坏死大鼠股骨头组织中RANKL、Cbfα1表达的影响

目的探讨补肾活血方治疗激素性股骨头坏死的可能作用机理。方法将120只SD大鼠随机分为正常组、模型组、中药组、西药组,每组30只。除正常组外其余各组大鼠臀部肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠20 mg/kg,每周注射2次,连续注射6周建立激素性股骨头坏死动物模型。造模后中药组给予浓度为96. 67 mg/ml补肾活血方水煎液2 ml灌胃,西药组给予浓度为1. 29 mg/ml的阿仑膦酸钠片水溶液2 ml灌胃。观察各组大鼠股骨头外观形态、HE染色后组织病理学改变,检测股骨头组织中细胞核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、核心结合因子α1 (Cbfα1)蛋白及mRNA表达。结果模型组大鼠股骨头毛糙无光泽,骨质疏松严重;西药组部分股骨头无粗糙面且色泽较鲜亮,偶有色泽稍微晦暗的情况,骨质较坚硬;中药组及正常组股骨头外观及形态正常,骨质坚硬。HE染色显示,模型组股骨头软骨细胞出现大面积坏死,排列不整齐,软骨细胞核聚缩,骨小梁内骨细胞明显减少,空骨陷窝明显增多。中药组股骨头软骨细胞排列欠规则,结构尚完整,空骨陷窝较少见,与正常组最为接近;西药组变化大致与中药组接近,但空骨陷窝较中药组多。中药组和西药组股骨头组织中RANKL、Cbfα1蛋白及mRNA表达均较模型组降低(P <0. 05),而中药组和西药组比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论补肾活血方可能通过下调股骨头组织中RANKL、Cbfα1的表达,从而促进股骨头坏死骨修复及股骨头新生骨的生成。

肿瘤骨转移患者采用中西医结合治疗的效果研究

目的探讨肿瘤骨转移患者采用中西医结合治疗的效果研究。方法将2018年1月—2019年12月在该院肿瘤科治疗的108例肿瘤骨转移患者随机分为两组,每组54例,对照组使用局部放疗+唑来膦酸治疗,在此基础上,观察组给予辨证论治、采用自拟补肾活血方加减治疗,对比两组的近期疗效、VAS疼痛评分、KPS评分、血清BSP指数、中医证候积分变化、生活质量。结果观察组疼痛缓解率为88.89%(48/54),明显高于对照组的74.07%(40/54)(P<0.05);观察组治疗后VAS疼痛评分、血清BSP指数明显低于对照组,而KPS评分明显高于对照组(P<0.05);观察组治疗后疼痛、腰膝酸软、神疲乏力、筋骨痿软、纳差消瘦、五心烦热等中医证候积分明显低于对照组(P<0.05);观察组治疗后躯体功能、情绪功能、认知功能、角色功能、物理症状、社会功能等EORTCQLQ-SF-36评分明显低于对照组,而整体健康状况评分明显高于对照组(P<0.05)。结论肿瘤骨转移患者采用中西医结合治疗的效果显著,能有效减轻癌痛,降低血清BSP指数,抑制破骨细胞分化,缩小骨转移灶,缓解中医证候,提升生存质量,具有积极的临床意义。