从药物多肽到蛋白质全合成:酶促拼接的方法原理与前沿应用

蛋白质是生命活动的基础功能元件,其化学合成与定点修饰已成为合成生物学领域探索复杂生物大分子“结构-功能”关系的重要前沿方向。近年来,以多肽固相合成与特异性拼接为核心的蛋白质合成和修饰技术蓬勃发展,打破了生命合成系统仅能使用天然及少数非天然氨基酸的瓶颈,为制备含有数百个氨基酸残基的非天然蛋白质提供了技术平台,让原子水平的蛋白质人工设计成为现实。作为一类广受关注的多肽拼接策略,基于天然或人工改造多肽连接酶的技术方法不仅在基础研究领域拓展了人们对蛋白质这一生命核心元件的理解,还在工业领域崭露头角,被应用于多种多肽类药物的生产。针对蛋白质合成领域中酶促多肽拼接技术平台,本文介绍了Sortase A转肽酶、Butelase 1转肽酶以及Subtilisin人工连接酶的来源以及催化过程,探讨了各自的优势以及局限性,并综述了三种酶在蛋白质修饰、蛋白质合成、多肽药物环化等方面的应用。通过计算机辅助设计、定向进化等技术对转肽酶、连接酶进行改造来提升其在底物谱、催化活性等方面的特性,将化学方法与酶促方法联用来建立多样的生物大分子从头设计与合成路线是目前的主要发展趋势。

末端环化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的稳定性

目的:获取活性高、稳定性好的工业脂肪酶。方法:利用哺乳动物细胞和大肠杆菌分别表达Butelase 1和梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL),通过Flag亲和层析和His亲和层析柱进行纯化;通过纯化的Butelase 1连接酶对重组TLL(rTLL)进行末端连接,以形成首尾相连的环状TLL(cTLL),通过测定rTLL和cTLL活性、热稳定性、蛋白酶稳定性、抗热聚沉能力等,研究环化处理对脂肪酶的影响。结果:纯化后cTLL与rTLL的比活基本相当;70℃下处理180 min,cTLL大部分可保持可溶状态,相同条件下线性蛋白TLL几乎完全沉淀或降低;环化后的脂肪酶cTLL粒径均一、分子量分布均匀,具有更稳定的蛋白特性。结论:Butelase 1可有效地环化梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶,环化后的蛋白酶酶活未改变,热稳定性大大提高,蛋白特性更好。