基于多组学解析布鲁氏菌BvfA对睾丸支持细胞线粒体NADH-泛醌氧化还原酶复合体的影响

【目的】明确布鲁氏菌BvfA对宿主睾丸支持细胞(TM4细胞)的损伤作用,以揭示布鲁氏菌对宿主的致病机制。【方法】利用RNA-Seq双端测序、Label-free蛋白组学技术和LC-MS非靶代谢组学技术分析感染布鲁氏菌S19△bvfA与S19菌株的TM4细胞的组学差异,采用KEGG数据库对差异表达蛋白及差异代谢物通路进行分析,并利用平行反应监测(PRM)对蛋白表达量进行验证。【结果】感染S19△bvfA和S19菌株的TM4细胞差异表达基因共400个,差异表达蛋白共422个,差异代谢产物共271种。多组学联合分析发现,S19△bvfA和S19菌株感染TM4细胞差异表达基因、差异表达蛋白和差异代谢产物共同富集的KEGG通路为内源性大麻素信号通路,在该通路中发现S19△bvfA菌株感染TM4细胞的线粒体NADH-泛醌氧化还原酶复合体(ComplexⅠ)中有20个蛋白表达量下调。PRM验证结果显示,ComplexⅠ中Ndufb11、Ndufa9、Ndufv1、Ndufv2、Ndufs8和Ndufs2蛋白的表达趋势与Label-free蛋白组学技术测定结果一致。【结论】BvfA在布鲁氏菌感染TM4细胞时能引起转录、蛋白质和代谢水平的变化,布鲁氏菌BvfA使睾丸支持细胞线粒体NADH-泛醌氧化还原酶复合体蛋白表达下调。

布鲁氏菌S19毒力基因BvfA的原核表达及生物信息学分析

试验旨在对布鲁氏菌S19毒力因子A(BvfA)基因进行克隆及原核表达,并对其编码的BvfA蛋白结构进行生物信息学分析。登录GenBank下载布鲁氏菌S19的1号染色体(登录号:CP030751.1),根据文献报道的布鲁氏菌S19 BvfA基因的位置和BvfA蛋白的分子质量,在NCBI的ORF Finder中预测编码BvfA蛋白的开放阅读框(ORF),根据ORF预测的BvfA基因设计扩增BvfA基因的引物,克隆该序列并连接到表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-32a(+)-BvfA,并诱导其在大肠杆菌BL21(Ril)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting验证,并用生物信息学方法对BvfA蛋白结构进行在线预测。结果显示,BvfA基因ORF全长为336 bp,表达纯化得到分子质量为11 ku的分泌型BvfA蛋白;生物信息学分析显示,BvfA蛋白属于不稳定的亲水性蛋白,无跨膜结构,第1-28位氨基酸处存在信号肽区域,BvfA蛋白55.6%定位于细胞外,有12个可能的磷酸化位点,无O-糖基化位点,BvfA蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。以上结果可为后续研究BvfA蛋白在布鲁氏菌中的致病机制及寻找布鲁氏菌病新的治疗靶点提供一定的参考。

bvfA基因对布鲁氏菌S19株生物学特性及睾丸支持细胞影响的研究

为研究布鲁氏菌毒力因子A(bvfA)对牛布鲁氏菌(B.abortus)S19菌株生物学特性及其感染睾丸支持细胞(TM4细胞)的影响,本研究利用振荡比浊法(D值法)测定S19(亲本株)、S19ΔbvfA(缺失株)及S19ΔbvfA/bvfA(回补株)3株菌的生长曲线;利用平板菌落计数法测定菌株对环境的应激水平、对TM4细胞的侵入能力及损伤性和对小鼠毒力的影响。结果显示:缺失株较亲本株和回补株生长速度显著降低(P<0.05);缺失株在热、高盐、高渗、强酸和多粘菌素B条件下生长均受到抑制,而在氧化应激条件下生长良好(P<0.05)。感染TM4细胞3 h时,缺失株未能侵入TM4细胞;12 h时,缺失株侵入TM4细胞的数量少于亲本株(P<0.01);24 h和48 h时,3株菌侵入TM4细胞的数量无显著性差异(P>0.05)。在感染12 h和24 h时,感染缺失株的TM4细胞死亡率高于感染亲本株的细胞死亡率(P<0.01);在48 h时,感染缺失株和感染亲本株的TM4细胞死亡率无显著性差异(P>0.05)。将各菌株腹腔注射感染小鼠,结果显示感染2周时缺失株感染小鼠的脾指数明显低于亲本株(P<0.01),且感染1周、2周和4周时,感染缺失株小鼠的脾分离菌量均小于亲本株(P<0.05)。本研究结果首次证实:bvfA基因参与调控布鲁氏菌S19菌株对环境的适应性,影响S19菌株对TM4细胞的侵入,抑制TM4细胞的死亡以维持细菌的生长增殖及其缺失能够降低S19菌株对小鼠的毒力。本研究结果为布鲁氏菌致病机制和bvfA基因的功能解析提供实验依据。