In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases

This study investigated the feasibility of using an hammerhead ribozyme against C Ⅱ TA, a major regulator of MHC Ⅱ antigens, to repress the expression of MHC Ⅱ molecules on Hela cells. A hammerhead ribozyme (Rz464) specific to 463-465 GUC triplet of C Ⅱ TA and its target gene were transcribed, then mixed up and incubated in vitro . The cleavage products were analyzed by PAGE and silver staining. Rz464 was then inserted into the pIRES2 EGFP vector (pRz464). Stable transfectants of Hela with pRz464 were tested for class Ⅱ MHC induction by recombinant human interferon gamma (IFN γ). mRNA of C Ⅱ TA was measured by RT PCR. Our results showed that Rz464 could exclusively cleave C Ⅱ TA RNA. When induced with IFN γ, the expression of HLA DR, DP, DQ on pRz464 + Hela was induced, and the mRNA content of C Ⅱ TA decreased too. It is concluded that Rz464 could inhibit C Ⅱ TA and thus the family of genes was regulated by C Ⅱ TA:MHC Ⅱ molecules. These results provided insight into the future application of Rz464 as a new nucleic acid drug against auto immune diseases.

CⅡTA基因修饰树突状细胞增强荷肝癌小鼠抗瘤效应

目的:探讨MHC-Ⅱ类分子反式激活因子(MHCclassⅡtransactivator)CⅡTA基因对树突状细胞(Dendriticcell,DC)表面MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86的上调作用,为肝癌生物治疗提供新的思路。方法:从小鼠骨髓中大量扩增DC,并用脂质体转染法将小鼠CⅡTA(mCⅡTA)基因转入DC中,用流式细胞术观察转染前、后DC表面MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子及CD80、CD86的表达。建立小鼠肝癌模型,将荷肝癌小鼠分为4组,第1组:分别于肝癌组织块周围注入PBS;第2组:未转入mCⅡTA基因的DC;第3组:转入mCⅡTA基因的DC;第4组:转入mCⅡTA基因并经H22肿瘤抗原刺激的DC。每周1次,连续接种3wk,连续7wk动态测量肝癌的大小,观察转染mCⅡTA基因对荷肝癌小鼠抗瘤效应的影响。结果:转染mCⅡTA基因使DC上MHC-Ⅰ/Ⅱ分子的表达率由74.2%/66.7%明显上调为93.6%/91.4%;CD80/CD86的表达率由52.3%/60.5%明显上调为89.7%/91.5%(P<0.05)。免疫接种后,第4组荷肝癌小鼠肝癌组织块的平均面积明显小于第1、2、3组(在第3、4、5、6、7周时,与第1、2组相比较,P<0.05;在第5、6、7周时与第3组相比较,P<0.05)。结论:转入mCⅡTA后,DC表面MHC-Ⅰ/Ⅱ分子及CD80/CD86的表达率明显上调,DC的抗瘤效应增强。本研究为将DC应用于肿瘤的生物治疗提供了新的途径。

抑制移植排斥的新途径——CⅡTA反义RNA的生物学活性

为了探讨CⅡTA的反义RNA对细胞表面主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC,亦称HLA)Ⅱ类抗原表达的抑制作用,克隆与人类CⅡTA基因第114-523位点之间序列互补的反义RNA(arCⅡTA)cDNA序列,并稳定转染Raji细胞,用流式细胞术检测经典MHCⅡ类抗原(HLADR、DP、DQ)表达,并应用RTPCR方法检测CⅡTA、经典MHCⅡ类及恒定链的mRNA水平。研究结果表明:arCⅡTA阳性Raji细胞与正义链组比较,HLADR、DP及DQ抗原表达分别降低了65.93%、54.14%、68.32%;同时CⅡTA、经典的MHCⅡ类及恒定链的mRNA含量均明显减少(P<0.05)。结论:CⅡTA反义RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法。

CⅡTA-pI在树突状细胞中特异启动活性的研究

目的 :检测MHCⅡ类分子反式激活因子Ⅰ型启动子 (CIITA pI)是否具有启动活性及其在树突状细胞 (dendriticcell,DC)中的特异启动活性。方法 :利用荧光素酶报告系统 ,检测仅 112bp的Ⅰ型CIITA pI在DC中的特异启动活性及报告基因在DC不同成熟程度下的表达。结果 :该启动子在DC中能够特异启动报告基因的表达 ,而在非DC细胞中几乎无启动活性 ;其启动活性随DC的成熟程度而上升。结论 :为进一步应用CIITA

靶向CⅡTA基因siRNA对大鼠角膜基质细胞MHCⅡ基因表达影响的研究

目的:探讨靶向主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类抗原转录激活因子(MHCⅡtransactivator CⅡTA)的化学合成小干扰RNA(small interfering RNA)抑制大鼠角膜基质细胞表面的MHCⅡ类抗原表达的可行性。方法:设计并合成靶向CⅡTA基因的5条siRNA,分离并培养大鼠角膜基质细胞,经重组大鼠IFN-γ刺激后,在阳离子脂质体的介导下,将siRNA转染大鼠角膜基质细胞。于转染后24h收集细胞,用荧光定量PCR方法检测CⅡTA和MHCⅡmRNA水平的变化;流式细胞仪检测MHCⅡ抗原表达的变化。结果:大鼠角膜基质细胞经重组大鼠IFN-γ刺激后,CⅡTA和MHCⅡ的表达大幅增强。荧光定量PCR检测显示化学合成的5条siRNA通过脂质体转染大鼠角膜基质细胞后,均能不同程度地抑制CⅡTA和MHCⅡ的表达,与对照组具有显著差异(P<0·01)。其中siRNA-4组的抑制作用最明显,对CⅡTA、MHCⅡ基因的mRNA抑制率分别为95·10%±1·25%、82·70%±1·95%。流式细胞仪检测显示siR-NA-4组对MHCⅡ抗原分子表达抑制率为81·90%±1·23%。结论:在大鼠角膜基质细胞中,靶向CⅡTAsiRNA抑制了自身mRNA表达,并阻止其调控的MHCⅡ类分子的相应表达。从而为进一步研究利用siRNA技术抑制MHCⅡ的表达防治角膜缘移植排斥反应提供了实验依据。

CⅡTA基因在5种人类细胞系中的表达及意义

本研究探讨5种细胞株中MHC-Ⅱ类抗原(HLA-DR、DP、DQ)表达及IFN-γ诱导后MHC分子与CⅡTA表达的关系。采用Western blot、免疫组织化学和流式细胞术检测5种细胞株中CⅡTA蛋白及MHC分子的表达,用RT-PCR检测细胞株中CⅡTA基因表达。结果表明:5种细胞株中MHC-Ⅱ类分子与CⅡTA的表达一致;组成型表达CⅡTA的细胞株亦表达MHC-Ⅱ类分子,经IFN-γ诱导后表达CⅡTA的细胞株表达MHC-Ⅱ类分子亦恢复;IFN-γ诱导后仍不表达CⅡTA的细胞株,对IFN-γ促MHC-Ⅱ类分子表达的作用亦无反应。结论:某些肿瘤细胞株不能表达MHC-Ⅱ分子与CⅡTA表达缺陷有关,这表明CⅡTA参与调控细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达,它可能在肿瘤免疫逃逸中起一定作用。

CⅡTA基因的应用研究进展

人 MHC-Ⅱ类分子反式激活因子（MHC classⅡtransactivator, CⅡTA）基因全长4,543bp,含有一个3,390bp长的开放读码框,编码一个含1,130个氨基酸的蛋白（分子量为123.5kDa）。它的表达水平直接影响着MHC-Ⅱ分子的表达量,是后者表达的主要调控因子,此外,它还参与激活MHC-Ⅰ类基因和多种抗原递呈相关基因［1,2］。本文就CⅡTA的主要应用研究进展进行综述。

抗CⅡTA的核糖核酸酶P对Jurkat细胞MHCⅡ类分子表达的抑制作用

本研究旨在探讨抗MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)的M1-RNA抑制细胞表面MHCⅡ类分子的表达。M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CⅡTA第3408位点的M1-RNA(M1-3408-GS)及其相应的CⅡTA靶基因片段(3176-3560),分别插入pUC19、pGEM-7zf(+)载体,进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作用明显的M1-3408-GS亚克隆入psNAV载体并稳定转染Jurkat细胞株,采用流式细胞术检测该细胞表面经典的MHCⅡ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平。结果表明:在重组人干扰素(IFN)-γ诱导下,M1-3408-GS阳性Jurkat细胞株与对照组比较,其表面HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ抗原诱导型表达分别降低了83.17%、94.12%及84.31%;同时CⅡTA的mRNA含量明显降低(P<0.05,t=4.89)。结论:抗CⅡTA的M1-RNA(M1-3408-GS)降低了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。

抗CⅡTA核糖核酸酶P抑制Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类抗原的表达

探讨抗MHC-Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)的核糖核酸酶P对Daudi细胞表面MHC-Ⅱ类分子表达的抑制作用.M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位.以pTK117质粒为模板,PCR扩增带有抗CⅡTA第452及629位点的引导序列的M1-RNA(M1-452-GS及M1-629-GS),再分别插入pUC19载体(pUC19-M1-452-GS和pUC19-M1-629-GS).从Raji细胞中克隆CⅡTA基因DNA片段(114～800)后插入pGEM-7zf(+)质粒.将重组M1-RNA与靶基因的mRNA进行细胞外共孵育,显示仅pUC19-M1-629-GS可特异性地切割靶基因mRNA.再将M1-629-GS克隆入psNAV载体(pA629)并稳定转染Daudi细胞株,RT-PCR检测其CⅡTA的mRNA水平,流式细胞术检测其HLA-DR、DP、DQ抗原表达.与对照组比较,M1-629-GS阳性Daudi细胞的CⅡTAmRNA含量减少90.19%(P<0·05),其HLA-DR、DP、DQ抗原表达分别降低91.97%、90.19%、92.36%(P<0·05).研究表明,抗CⅡTA的核糖核酸酶P可通过抑制CⅡTA的转录而降低Daudi细胞表面的MHC-Ⅱ类分子的表达.

强的松对CⅡTA调节HLA作用的影响

目的:研究强的松对人PBMCCⅡTA转录的调节,从基因水平探讨糖皮质激素对HLA的调控作用及其调控机制。方法:用强的松干预经IFN-γ联合PHA刺激诱导活化的正常人PBMC,采用RT-PCR方法扩增其CⅡTA mRNA,并对处理后PBMCCⅡTA转录水平与未诱导的组成性及活化后的诱导性CⅡTA转录水平进行分析比较。结果:体外培养的正常人PBMC组成性表达CⅡTA,经IFN-γ联合PHA活化后表达增加,强的松干预后,表达量明显减少。结论:强的松对IFN-γ诱导活化的PBMCCⅡTA转录有抑制作用,对HLA表达的抑制作用可能与下调CⅡTA转录有关。

CⅡTA研究进展

CⅡTA(MHCclassⅡtransactivator)是近年新发现的转录活化因子 ,对MHCⅡ类分子的表达起严格且专一的调控作用。CⅡTA通过其细胞和组织专一性的启动子表达不同的转录本 ,并以此调节MHCⅡ类分子在不同组织及时段的特异性表达。CⅡTA蛋白与基础转录复合物及多种MHCⅡ类基因转录因子之间存在相互作用 ,并与之形成复合物以实现转录活化功能。对CⅡTA基因结构和功能的研究将极大地促进其在免疫调节和疾病治疗研究中的应用。

CⅡTA核酶对肝细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制

目的:探讨抗CⅡTA核酶对肝细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制作用。方法:设计并克隆针对CⅡTA第134、218及464位点的核酶(分别为Rz134、Rz218、Rz464)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM-T载体,进行细胞外切割活性筛选。将切割作用明显的Rz464亚克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP(pIRES2-EGFP-Rz464,pRz464)进行细胞内切割分析。pRz464稳定转染人胎肝细胞,流式细胞术检测MHCⅡ(HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ)类抗原表达,RT-PCR分析CⅡTAmRNA水平。结果:pRz464肝细胞表面HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ的诱导型表达分别为(1.01±0.51)%、(4.37±1.28)%和(1.98±0.42)%,与对照组比较分别下调90.65%、89.11%及65.32%;同时CⅡTA的诱导型mRNA含量明显减少(P<0.01)。结论:抗CⅡTA核酶-Rz464降低了CⅡTA的mRNA含量,从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。

反义CⅡTA基因对鼠异位气管移植慢性免疫排斥反应的抑制作用

目的:构建携带鼠MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC classⅡmolecule transactivator,CⅡTA)反义RNA的腺病毒载体,观察腺病毒介导该基因对小鼠异位气管移植慢性免疫排斥反应的抑制作用。方法:设计鼠CⅡTA mRNA为模板的反义片段,构建可表达反义片段的腺病毒载体(AdEasy-1系统),经HEK293细胞包装产生含反义片段重组腺病毒Ad-asCⅡTA,扩增、纯化。建立小鼠异位气管移植模型,用包装后的腺病毒注射并感染移植体周围,观察其对免疫排斥反应的抑制作用。结果:成功包装出含CⅡTA反义基因的重组腺病毒;重组腺病毒可感染气管移植体,Ad-asCⅡTA感染组移植气管组织炎症反应和纤毛上皮变性坏死等较对照组明显减轻。结论:重组腺病毒表达的小鼠反义CⅡTA基因能通过对MHCⅡ类分子的抑制而抑制异位气管移植的慢性免疫排斥反应。这为气管移植治疗气管肿瘤和气管狭窄等疾病奠定了一定的实验基础。

转染CⅡTA基因上调小鼠树突状细胞表面MHC分子和共刺激分子的表达

目的探讨MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC classⅡtransactivator,CⅡTA)基因对树突状细胞(Dendriticcell,DC)表面MHC-Ⅰ/-Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86的调节作用,为将树突状细胞应用于生物治疗奠定基础。方法从小鼠骨髓中大量扩增DC,用脂质体转染法将小鼠CⅡTA(mCⅡTA)基因转入DC中,用流式细胞术观察转染前、后DC表面MHCⅠ-/-Ⅱ类分子及CD80、CD86的表达。结果转染mCⅡTA基因使DC上MHC-Ⅰ/-Ⅱ分子的表达率由74.2%/66.7%明显上调为93.6%/91.4%;CD80/CD86的表达率由52.3%/60.5%明显上调为89.7%/91.5%(P<0.05)。结论转入mCⅡTA可使DC表面MHC-Ⅰ/-Ⅱ分子及CD80/CD86的表达率明显上调。本研究为将DC应用于肿瘤的生物治疗奠定了基础。

CⅡTA基因在五种人类恶性血液病细胞株细胞中的表达及意义

目的:探讨5种血液病细胞株细胞的HLA-Ⅱ类抗原表达,以及对IFN-γ诱导HLA分子表达的反应性与MHCⅡ类分子反式激活因子(CⅡTA)表达的关系。方法:采用流式细胞术和免疫组化法检测肿瘤细胞HLA分子及CⅡTA蛋白的表达,RT-PCR检测肿瘤细胞CⅡTA基因表达。混合淋巴细胞反应检测肿瘤细胞刺激外周血T细胞反应的能力。结果:肿瘤细胞HLAⅡ类分子表达与CⅡTA表达一致;结构型或诱导型表达CⅡTA的肿瘤细胞,经IFN-γ作用后其HLAⅠ、Ⅱ类抗原表达增高;IFN-γ诱导后仍不表达CⅡTA的肿瘤细胞,其对IFN-γ促HLAⅡ表达的作用不反应。Jurkat诱导后刺激T细胞表达高水平的IL-2mRNA。结论:某些恶性血液病细胞株细胞对IFN-γ不能诱导HLA分子表达与CⅡTA诱导型表达缺陷有关,表明CⅡTA参与调控肿瘤细胞HLAⅠ、Ⅱ类抗原表达,可能在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。

CⅡTA反义基因体外转染对HLA-Ⅱ类抗原表达的抑制作用的研究

目的:针对同种异体细胞移植的免疫反应主要由HLA-Ⅱ类抗原介导,而CⅡTA基因对HLA-Ⅱ分子的表达起严格且专一性的调控作用,拟通过CⅡTA的反义cDNA抑制细胞表面HLAⅡ分子的表达。方法:以RT-PCR从HLAⅡ抗原组成型表达的Raji细胞株克隆CⅡTA反义片段(arⅡ),插入腺相关病毒载体psNAV中(pAarⅡ)。将该质粒通过脂质体稳定转染Heda细胞(pAar Ⅱ H),检测其表面HLAⅡ分子表达,并以RT-PCR检测其CⅡTA、HLA-Ⅱ(DR、DP及DQ)及Ii分子的mRNA水平。结果:pAarⅡH在重组人IFN-γ诱导下,DR、DP及DQ抗原表达分别降低了79±12%、90±15%及40±8%;同时HLA-Ⅱ及Ii分子的mRNA被明显抑制。结论:提示CⅡTA反义基因片段抑制了自身组成型及诱导型表达量,并相应阻止了CⅡTA所调控的基因(HLA-Ⅱ及Ii)的表达,从而为进一步探讨免疫耐受形成及其在组织工程中的应用奠定了基础。

乙型肝炎慢性化与CⅡTA基因启动子区多态性的相关性

目的 :探讨CⅡTA基因启动子区的多态性与乙型肝炎慢性化的相关性 .方法 :用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)及DNA测序方法对 1 0 2例慢性乙型肝炎患者和80例正常对照者外周血白细胞基因组DNA的CⅡTA基因Ⅰ ,Ⅲ及Ⅳ 3个启动子的基因多态性进行分析 .结果 :1 0 2例患者和 80例正常人CⅡTA基因的第Ⅰ ,Ⅲ及Ⅳ 3个启动子的PCR产物均呈一带型 ,未发现异常泳动 .结论 :PCR SSCP分析显示CⅡTA基因的第Ⅰ ,Ⅲ及Ⅳ 3个启动子在所研究的人群中不存在多态性 。

CⅡTA对MHCⅠ/Ⅱ类分子的反式激活作用

CⅡTA(MHCclassⅡtransactivator)指MHCⅡ类分子反式激活因子 ,与MHCⅠ /Ⅱ类基因及各种抗原递呈相关基因的表达密切相关 ,涉及的机理较为复杂。本文拟就CⅡTA对MHCⅠ

雷公藤内酯通过下调CⅡTA抑制BV-2小胶质细胞MHCⅡ表达

目的观察雷公藤内酯对海人酸活化的BV-2小胶质细胞MHCⅡ分子表达的影响,并探讨其相关的分子机制。方法将BV-2细胞随机分为对照组、海人酸组、雷公藤內酯组,免疫组化方法检测雷公藤内酯对海人酸活化的BV-2细胞MHCⅡ和CⅡTA蛋白的影响。结果对照组MHCⅡ阳性BV-2细胞为(0.059±0.005),海人酸组MHCⅡ阳性BV-2细胞为(0.893±0.038),经统计学处理二者存在显著性差异(P<0.05)。雷公藤内酯组MHCⅡ阳性BV-2细胞率(0.089±0.013),与海人酸组比较二者存在显著性差异(P<0.05);对照组CⅡTA阳性BV-2细胞为(0.043±0.003),海人酸组CⅡTA阳性BV-2细胞为(0.692±0.015),经统计学处理二者存在显著性差异(P<0.05)。雷公藤内酯组CⅡTA阳性BV-2细胞为(0.057±0.009),与海人酸组比较存在显著性差异(P<0.05)。结论雷公藤内酯可以抑制海人酸活化的BV-2细胞MHCⅡ表达,其机制可能与下调BV-2细胞CⅡTA表达有关。