西红花苷通过C/EBP-β/PGC-1α/UCP3途径对缺血缺氧损伤心肌的保护作用

目的探讨西红花苷对异丙肾上腺素所致心肌缺血缺氧模型大鼠的保护作用,并验证其作用机制是否与C/EBP-β/PGC-1α/UCP3信号通路有关。方法皮下注射异丙肾上腺素建立大鼠缺血缺氧模型后,分别灌胃给予西红花苷不同剂量干预(25、50、100mg/kg)。比较各组大鼠血清LDH-1、CK-MB、MDA、TNF-α、NO水平以及大鼠CI及心肌梗死面积;比较各组心肌Akt、ERK1/2、C/EBP-β、PGC-1α、UCP3蛋白及基因表达水平。结果与空白对照组比较,模型组大鼠存活率极显著降低(P<0.01),血清LDH-1、CK-MB、MDA、TNF-α、NO水平、CI及心肌梗死面积均极显著升高(P<0.01);心肌纤维排列紊乱且炎性细胞浸润明显;心肌Akt、ERK1/2蛋白表达均显著升高(P<0.05),C/EBP-β、UCP3蛋白及mRNA表达均极显著升高(P<0.01),PGC-1α蛋白及mRNA表达极显著降低(P<0.01)。与模型组比较,阳性对照组大鼠存活率显著升高(P<0.05),血清LDH-1、CK-MB、MDA、TNF-α、NO水平、心肌梗死面积均极显著降低(P<0.01),CI显著降低(P<0.05),心肌纤维排列整齐且炎性细胞浸润明显减轻;Akt、ERK1/2蛋白表达均极显著升高(P<0.01),C/EBP-β蛋白及mRNA表达均极显著降低(P<0.01),PGC-1α蛋白表达极显著升高(P<0.01)而mRNA表达显著升高(P<0.05),UCP3蛋白表达无差异而mRNA表达显著升高(P<0.05)。与模型组、对照组比较,西红花苷中、高剂量均可显著提高大鼠存活率(P<0.05);显著降低大鼠血清LDH-1、CK-MB、MDA、TNF-α及NO水平(P<0.05);显著降低CI及心肌梗死面积(P<0.05);减轻炎症浸润且提高心肌细胞完整程度;显著升高心肌Akt、ERK1/2蛋白表达水平(P<0.05);显著降低心肌C/EBP-β蛋白及mRNA表达水平(P<0.05),显著升高PGC-1α、UCP3蛋白及mRNA表达水平(P<0.05);其中高剂量组综合效果较好。结论西红花苷对大鼠缺血缺氧损伤心肌具有明显的保护作用,其机制可能与调节C/EBP-β/PGC-1α/UCP3信号通路相关。

扶正抗癌方通过miR155-C/EBP-β途径逆转M2型巨噬细胞极化

目的:探讨扶正抗癌方(fuzheng kangai formula,FZKA)对小鼠M2型巨噬细胞RAW264.7极化的影响及其作用机制。方法:采用白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)作用RAW264.7细胞48 h建立巨噬细胞M2型极化模型,利用流式细胞术、实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法检测M2型标志物巨噬细胞甘露糖受体(CD)206、CD163和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)以及M1型标志物一氧化氮合成酶(inductible nitric oxide synthase,iNOS)的表达,将扶正抗癌方作用于M2型巨噬细胞后,检测M1及M2型巨噬细胞标志物、转录因子CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT enhancer-binding proteinβ,C/EBP-β)和miR155的表达,利用瞬时转染法将miRNA模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitors)转入细胞后检测C/EBP-β及巨噬细胞极性的变化。结果:在IL-4(20 ng•mL^(-1))作用下,CD206、CD163、TGF-β的表达增加(P<0.01),iNOS表达降低(P<0.01),IL-4成功诱导巨噬细胞向M2型极化;加入扶正抗癌方后CD206、CD163和TGF-β的表达降低(P<0.01),iNOS表达增加(P<0.01),扶正抗癌方可逆转M2型巨噬细胞的极化,同时C/EBP-βmRNA和蛋白的表达降低(P<0.01),miR155的表达增加(P<0.01);将miRNA的mimics和inhibitors转染至M2型巨噬细胞后miR155的表达分别增加和降低(P<0.01),miR155 mimics和inhibitors转染成功;在M2型巨噬细胞中转入miR155 inhibitors后,C/EBP-βmRNA的表达增加(P<0.01),miR155可靶向抑制C/EBP-βmRNA的表达;M2型巨噬细胞中转入miR155 inhibitors后加入扶正抗癌方,CD206和CD163表达增加(P<0.01,P<0.05),miR155 inhibitors抑制了扶正抗癌方对M2型巨噬细胞极化的逆转。结论:扶正抗癌方可通过上调miR155的表达,进而靶向抑制C/EBP-β基因的表达,并进一步通过下调M2型巨噬细胞标志物CD206、CD163和TGF-β,上调M1型巨噬细胞标志物iNOS的表达,逆转M2型巨噬细胞的极化。

转录因子C/EBP-β促进人子宫内膜基质细胞蜕膜化进程

目的:探讨转录因子C/EBP-β在人子宫内膜基质细胞体外蜕膜化过程中的表达变化及其作用。方法:采用8-Br-cAMP和MPA对人子宫内膜基质细胞体外蜕膜化处理,并通过瞬时转染的方法下调C/EBP-β的表达,分别收集蜕膜化处理不同时间及干扰前后的细胞及其培养上清液,采用Western blot和荧光适时定量RT-PCR分别在蛋白质水平和mRNA水平检测转录因子C/EBP-β在蜕膜化过程中的表达变化,采用化学发光法检测蜕膜化不同时间点培养液中泌乳素(PRL)的浓度及干扰前后PRL表达水平的变化。结果:免疫印迹结果显示人子宫内膜基质细胞在体外蜕膜化过程中C/EBP-β蛋白的表达随蜕膜化时间的延长逐渐升高(0.068、0.140、0.316、0.595),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);荧光适时定量RT-PCR也证实C/EBP-βmRNA的表达随蜕膜化时间的延长明显增加(0.020、0.054、0.094、0.486),与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。化学发光法检测到在蜕膜化过程中细胞分泌的PRL水平随蜕膜化时间延长逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05),而转染C/EBP-βsiRNA后细胞分泌的PRL浓度则明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:转录因子C/EBP-β在人子宫内膜基质细胞体外蜕膜化进程中上升性表达,在蜕膜化过程中可能发挥着重要的促进作用。

转录因子C/EBP-β在人子宫内膜中的表达

目的:探讨转录因子C/EBP-β在人正常子宫内膜及早孕蜕膜中的表达及其变化规律。方法:采用免疫组化进行组织学定位,采用免疫印迹进行蛋白质定量,采用RT-PCR进行mRNA检测,在蛋白质水平和mRNA水平检测人正常月经周期子宫内膜及早孕蜕膜中转录因子C/EBP-β的表达变化。结果:C/EBP-β蛋白主要在人子宫内膜基质细胞核中表达,C/EBP-β蛋白及mRNA在增生期C/EBP-β仅有弱表达,分泌期显著增加(P<0.05),以分泌晚期表达最强,在早孕蜕膜组织中也有较强的表达(P<0.05)。结论:C/EBP-β在人正常子宫内膜分泌晚期及早孕蜕膜组织中呈现较强的表达,可能在胚胎着床及妊娠的维持中发挥着重要的调节作用。

转录因子C/EBP-β调节人子宫内膜基质细胞蜕膜化作用机理研究

目的探讨转录因子C／EβP—β调节人子宫内膜基质细胞蜕膜化的作用机制。方法采用8-Br—cAMP和MPA方法对人子宫内膜基质细胞体外蜕膜化实施处理分析，并通过瞬时转染方法调节转录因子C／EBP—β表达，然后分别收集蜕膜化处理不同时间及干扰前后的细胞，利用流式细胞仪检测细胞蜕膜化不同时间细胞分期的改变情况以及干扰前后细胞周期的变化，并采用Western blot和荧光定量实时PCR法（RT—PCR）分别在mRNA水平和蛋白质水平下检测细胞周期蛋白p57在转染siRNA组和对照组中的表达情况。结果子宫内膜基质细胞在体外蜕膜化中S期细胞的比例随着细胞蜕膜化时间的增长而减少，而G0／G1期细胞的比例随着细胞蜕膜化时间的增长呈现明显的上升趋势，G2／M期细胞的比例随着细胞蜕膜化时间的增长而显著下降，差异均有统计学意义（P〈0．05）；而转染C／EBP—β siRNA后再蜕膜化48h后的S期细胞比例变化范围为4．28％-6．88％，差异有统计学意义（P〈0．05）；G0／G1期细胞比例范围为86．07％～87．34％，G2／M期细胞比例范围为7．04％～8．38％，均呈逐渐下降趋势，但差异无统计学意义（P〉0．05）；且转染C／EBP—β siRNA以后，对人子宫内膜基质细胞中细胞周期蛋白p57的表达进行检测分析，发现p57的表达有明显的下降趋势，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论转录因子C／EBP—β在人子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中通过调节细胞周期蛋白p57使细胞脱离其周期而分化为一种新的蜕膜细胞，在蜕膜化过程中发挥重要作用。

内质网应激凋亡途径对H9C2细胞缝隙连接蛋白43表达的影响及稳心颗粒的干预研究

目的:研究内质网应激凋亡途径对大鼠心肌H9C2细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响及稳心颗粒的干预作用。方法:体外培养H9C2细胞,分为对照组、模型组、salubrinal(Sal)组、稳心颗粒组;采用毒胡萝卜素(TG)诱导内质网应激凋亡模型,以经典凋亡抑制剂Sal抑制凋亡,采用CCK-8比色分析法筛选药物浓度及时间,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting法检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP-同源蛋白(CHOP)、天冬氨酸胱氨酸特异性蛋白酶-12(Caspase-12)、Cx43的表达。结果:CCK-8结果提示,TG、Sal和稳心颗粒的最佳浓度分别为0.1、20μmol·L^-1和10 g·L^-1,作用时间均为24 h。流式细胞仪检测结果显示,与对照组比较,其余3组的细胞凋亡率显著增加;与模型组比较,Sal组及稳心颗粒组的细胞凋亡率都明显下降。Western blotting结果中,与对照组比较,模型组细胞GRP78、CHOP及Caspase-12蛋白表达水平显著增高,而Cx43蛋白表达水平显著降低;与模型组比较,Sal组和稳心颗粒组细胞CHOP、Caspase-12蛋白表达水平显著降低,Cx43蛋白表达水平显著升高,Sal组细胞GRP78蛋白表达差异无统计学意义,稳心颗粒组GRP78蛋白表达水平显著升高。结论:TG诱导的内质网应激凋亡途径会影响Cx43的表达,稳心颗粒可以通过抑制内质网应激凋亡途径调节H9C2细胞Cx43的表达水平。

大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C/EBP β结合位点的鉴定

目的 :构建大鼠IL-6基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞(HEK293)中过表达CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)对该质粒基因启动子活性的影响。同时,筛选C/EBPβ与IL-6基因启动子区的结合位点。方法:采用PCR技术,扩增出大鼠IL-6基因启动子全长序列(-1 791～+30 nt),将IL-6基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。将IL-6基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-IL-6-1)和大鼠野生型C/EBPβ表达质粒(pIRES2-EGFP-C/EBPβ)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定C/EBPβ对IL-6基因的启动作用。另用生物信息学软件预测IL-6基因启动子上C/EBPβ潜在的结合位点,并构建IL-6基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-IL-6-2～5)。将上述IL-6基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和C/EBPβ过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选出C/EBPβ的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功。将pGL3-IL-6-1和pIRES2-EGFP-C/EBPβ共转染HEK293细胞发现,IL-6基因启动子活性显著增加。另将pGL3-IL-6-1、pGL3-IL-6-2～5和pIRES2-EGFP-C/EBPβ共转染HEK293细胞后发现,pGL3-IL-6-5的启动活性显著低于其他组。提示C/EBPβ可能结合在IL-6基因启动子的-618 bp～-126 bp区域。结论:成功构建了大鼠IL-6基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出了C/EBPβ在IL-6基因启动子上的结合部位。

N-乙酰半胱氨酸活性炭缓释微囊对幼鼠非酒精性脂肪肝病miRNA的影响

目的:初步研究N-乙酰半胱氨酸活性炭缓释微囊对幼鼠非酒精性脂肪肝病的保护作用,并且探讨其对mi RNA及相应的靶基因的影响。方法:采用高脂饲料喂养的方法复制幼鼠非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型。HE染色观察幼鼠肝组织脂肪变性程度;micro RNA芯片检测肝组织的mi RNA表达谱;荧光定量PCR对mi RNA进行验证;采用荧光定量PCR和Western blot法对目标mi RNA进行靶基因预测并进行验证。结果:根据检测结果,初步确定mi RNA199a-5p和mi RNA-378-5p是NAFLD的关键mi RNA,脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,Lpl)是mi RNA199a-5p的靶基因,固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins-1,Srebp1)、CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alfa,C/EBP-α)是mi RNA-378-5p的靶基因。结论:推测N-乙酰半胱氨酸活性炭缓释微囊可能通过上调Lpl表达水平,下调Srebp1和C/EBP-α表达水平。这些基因与脂肪肝密切相关,可能对幼鼠NAFLD具有保护作用。

维吾尔族宫颈鳞癌C/EBP β基因甲基化与HPV16感染关系

目的通过对新疆维吾尔族妇女宫颈鳞癌组织C/EBPβ基因甲基化与HPV16感染关系的研究,探讨该基因在宫颈癌发生发展过程中的作用。方法提取26份子宫颈癌组织和16份子宫颈正常组织DNA,用PCR方法对样本进行HPV16检测,再利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱方法进行C/EBPβ基因甲基化分析。结果子宫颈鳞癌组织HPV16感染率为69.32%(18/26),2份正常子宫颈组织感染HPV16,差异有统计学意义(χ2=12.780,P<0.05);子宫颈鳞癌与子宫颈正常组织中C/EBPβ基因CpG10/11和CpG17/18 2个CpG岛甲基化差异有统计学意义(t=2.221、2.278,P均<0.05);C/EBPβ基因在以上2个CpG岛位点上的甲基化率与HPV16感染偏相关系数分别为1.323和-4.36,差异无统计学意义(P>0.05)。结论新疆维吾尔族妇女宫颈鳞癌发生与HPV16感染相关;C/EBPβ基因2个CpG岛位点甲基化与维吾尔族子宫颈鳞癌发生相关,而与HPV16感染无相关性。

转录因子C/EBPβ对肝癌细胞SMMC-7721影响

目的探讨靶向CCAAT/增强子结合蛋白-β(C/EBPβ)基因沉默对肝癌细胞SMMC-7721增殖、凋亡、迁移的影响。方法设计C/EBP-β及e GFP、shRNA序列,装入p LKO.1-TRC质粒,进行慢病毒包装,感染肝癌SMMC-7721细胞,嘌呤霉素筛选并培养稳定干扰细胞株,cell counting kit-8(CCK-8试剂盒)法、transwell细胞迁移实验分别检测沉默C/EBP-β基因对SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响,蛋白印迹(Western blot)检测干扰效率及沉默C/EBP-β基因对SMMC-7721细胞的凋亡相关蛋白影响。结果沉默C/EBP-β基因的SMMC-7721-p LKO-sh-C/EBP-β肿瘤细胞的增殖速度明显提高(相对增值率136.8%,P<0.05),细胞迁移能力也明显增强(迁移抑制率为-292.3%,P<0.05),且细胞周期蛋白cyclin B1的表达增强(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达增强(P<0.05),凋亡相关蛋白Bax的表达下降(P<0.05)。结论沉默C/EBP-β对肝癌细胞SMMC-7721的增殖、迁移有促进作用,对其凋亡有抑制作用。

C/EBP β对APP基因的表达调控作用的研究

该研究成功地构建了C/EBP β过表达慢病毒载体,在体外人胚肾细胞(HEK293FT)进行病毒包装并感染小鼠海马神经元细胞(HT22)。通过荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)检测C/EBPβ对淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)启动子活性的影响;通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)来检测C/EBPβ对APP和Sp1在转录水平上的表达;通过蛋白免疫印迹分析(Western blot assay)检测C/EBPβ对APP和Sp1蛋白表达的作用。萤火虫荧光素酶分析结果显示,C/EBPβ对APP启动子的表达有正调控作用;Western blot和Q-PCR分析的结果表明,C/EBPβ对APP和Sp1基因的表达有正调控作用。C/EBPβ对APP基因表达的调控作用的机制可能在于C/EBPβ上调了内源性转录因子Sp1的基因表达,而Sp1基因表达的增强直接导致了APP基因表达的上调。