抗FcεRI抗体、C5a的表达对慢性自发性荨麻疹的影响

目的:探讨慢性自发性荨麻疹患者体内血清中抗FcεRI自身抗体、C5a水平的关系;抗FcεRI自身抗体、C5a与慢性自发性荨麻疹的活跃程度、控制情况的相关性。方法:收集2021年2月至2023年2月于石河子大学第一附属医院皮肤科门诊及住院部收治的诊断为慢性自发性荨麻疹患者(符合纳排标准)病情评价量表、皮损照片及其血液样本共82例,体检的健康者(符合纳排标准)血液样本80例,通过病史查询及调查问卷获得两组的临床资料,通过SPSS 26.0系统分析比较两组之间的抗体水平差异。结果:慢性自发性荨麻疹患者血清抗FcεRI抗体和C5a的水平明显高于健康人群组(P<0.05),慢性自发性荨麻疹患者血清抗FcεRI抗体和C5a的水平存在正相关性(P<0.05);慢性自发性荨麻疹患者血清抗FcεRI抗体、C5a含量与疾病严重程度不存在正相关性(P值均>0.05)。结论:肥大细胞相关自身抗体-抗FcεRI、C5a与慢性自发性荨麻疹发生发展相关;C5a水平与抗FcεRI水平呈正相关;血清抗FcεRI抗体、C5a含量与荨麻疹活跃程度及荨麻疹症状控制情况无相关性,抗FcεRI抗体、C5a可作为CSU的辅助诊断指标。

益气健脾抗癌法对结肠癌组织PKC及亚型PKCδ、PKCε蛋白表达的影响

目的:探索益气健脾抗癌法对大肠癌组织蛋白激酶C(protein kinase C;PKC)及亚型PKCδ、PKCε表达的影响及其作用机制。方法:建立人大肠癌细胞HT-29裸鼠皮下移植瘤模型后,随机分为模型组、益气健脾组和益气健脾抗癌组。益气健脾中药由太子参、茯苓、白术、甘草、半夏、陈皮等组成,益气健脾抗癌中药由益气健脾中药加山慈菇、土茯苓、浙贝母和白花蛇舌草等组成。给药14 d后,应用Real-time PCR和Western blotting法检测肿瘤组织PKC及其亚型PKCδ、PKCε的mRNA及蛋白的表达。结果:益气健脾抗癌法治疗后,移植瘤组织中:(1)PKC mRNA和PKC蛋白表达低于模型组和益气健脾组[(0.412±0.040)vs(0.596±0.021)、(0.540±0.015)和(0.261±0.019)vs(0.665±0.016)、(0.498±0.018),P<0.05或P<0.01];(2)PKCδ mRNA和PKCδ蛋白表达高于模型组和益气健脾组[(0.410±0.030)vs(0.233±0.025)、(0.261±0.034)和(0.516±0.029)vs(0.301±0.041)、(0.361±0.044),均P<0.01];(3)PKCε mRNA和PKCε蛋白表达低于模型组和益气健脾组[(0.215±0.021)vs(0.362±0.021)、(0.314±0.031)和(0.224±0.029)vs(0.368±0.044)、(0.359±0.029),均P<0.01)。结论:益气健脾抗癌法对大肠癌组织PKC、PKCε的抑制及PKCδ的促进作用,可能是益气健脾抗癌法治疗大肠癌的作用机制之一。

PKCε-siRNA对人宫颈癌ME180细胞增殖与侵袭能力影响的实验研究

目的:探讨PKCε-siRNA对人宫颈癌ME180细胞蛋白激酶Cε(PKCε)mRNA、蛋白表达及ME180细胞增殖与侵袭能力影响。方法:建立PKCε-siRNA转染组(实验组)、NC-siRNA转染组(阴性对照组)、未行处理组(对照组)。Real-time PCR法检测各组细胞PKCεmRNA表达。Western-blot法检测各组PKCε、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达。采用MTT比色法观察各组细胞增殖能力,采用划痕实验观察各组细胞迁移能力,采用Transwell法观察各组细胞侵袭能力,荧光素酶报告基因检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的活性。结果:与对照组相比,实验组PKCεmRNA明显降低,表达量为对照组的18.3%,两组差异有统计学意义(P<0.05)。PKCε、Cyclin D1、MMP-2蛋白表达水平明显降低。在MTT实验中,实验组细胞72小时的A值为0.517±0.031,与对照组(0.925±0.063)相比增殖能力明显降低,两组差异有统计学意义(P<0.05)。实验组迁移和侵袭能力明显低于对照组。实验组MAPK转录活性(4.5±0.2)低于对照组(16.3±0.9),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:通过siRNA技术降低PKCε表达,可有效干扰MAPK通路,明显抑制宫颈癌ME180细胞增殖及迁移侵袭能力。

BBN诱发PLCε基因敲除小鼠膀胱癌发生过程中病变细胞超微结构改变

目的动态观察诱癌剂N-丁基-N2(4-羟丁基)亚硝胺(BBN)诱发磷脂酶Cε(PLCε)基因正常(PLCε+/+)小鼠和PLCε基因敲除(PLCε-/-)小鼠膀胱肿瘤超微结构发生发展的过程,研究PLCε在膀胱肿瘤形成中的作用。方法PLCε+/+和PLCε-/-小鼠各72只随机分成2组,分别给予BBN和自来水喂饲,实验周期为18W,按计划处死大鼠,在电子显微镜下观察不同阶段动物膀胱癌的发生情况。结果PLCε+/+小鼠和PLCε-/-小鼠膀胱癌的发生经历了3个阶段的形态变化过程:(1)上皮增生期;(2)乳头状瘤形成期;(3)癌变期。电镜显示的各阶段超微结构变化,以膀胱黏膜移行上皮表层细胞的变化最具有形态学意义,其中移行上皮非对称性单位膜的改变、多形性微绒毛形成、梭形小泡形成、微丝及连接复合体减少所致的壳层丧失,胞浆内溶酶体增多及印戒细胞形成、核周纤维层不规则或消失是癌变的重要依据,因此可作为膀胱黏膜上皮早期癌变的超微结构学标志。结论PLCε-/-小鼠的肿瘤形成时间迟于PLCε+/+小鼠,肿瘤发生率也低于PLCε+/+小鼠提示敲除PLCε基因可以抑制膀胱肿瘤的形成。

TRPV4和PKCε在糖尿病大鼠背根神经节神经元中的表达

目的探讨糖尿病不同时期蛋白激酶Cε(PKCε)和瞬时性受体电位通道4(TRPV4)在大鼠DRG神经元中的表达及意义。方法采用经典糖尿病模型,检测不同病程糖尿病大鼠DRG神经元中PKCε和TRPV4的表达。用免疫荧光方法,观察背根神经节(DRG)在痛性糖尿病神经病变(PDN)过程中PKCε和TRPV4阳性细胞的变化。结果 PKCε和TRPV4在正常大鼠的背根神经节中均有表达。在糖尿病大鼠中,PKCε和TRPV4的表达水平都出现先升高后降低的现象。其中,PKCε在糖尿病第4周的表达水平最高,TRPV4在糖尿病第1周的表达水平最高。结论高糖慢性刺激可导致DRG神经元PKCε和TRPV4的表达改变,在短期内有明显的增加,但2者高峰出现的时间不同。TRPV4的增加依赖于PKCε,而后者错后的高峰说明其参与更多的细胞内机制。

偏头痛模型大鼠三叉神经脊束核神经元兴奋性增高及蛋白激酶Cε膜转位增加

目的:探讨蛋白激酶Cε(protein kinase Cε,PKCε)对偏头痛中枢敏感化大鼠三叉神经脊束核神经元兴奋性的影响。方法:实验选取200～250 g雄性SD大鼠共60只;随机均分为正常组(N组)、假手术组(C组)、偏头痛模型组(M组)、氯仿组(L组)和PKCε抑制剂H-7组(H-7组),每组大鼠12只。进行三叉神经脊束核神经元放电记录和PKCε膜转位水平检测。结果:(1)放电频率变化百分比:造模后,三叉神经脊束核细胞外放电频率增加,造模后2 h为造模前的(325.88±47.32)%;M放电频率变化百分比高于N组和C组。L组放电频率变化百分比与M相比,差异无统计学意义;H-7组放电频率变化百分比低于M和L组。(2)膜转位水平:M组、L组PKCε膜转位水平高于N组和C组;L组与M组相比,PKCε膜转位水平无明显变化;H-7组膜转位水平低于其余四组。结论:偏头痛中枢敏感化过程中,三叉神经脊束核神经元兴奋性和PKCε膜转位增加,PKCε抑制剂H-7能减少神经元兴奋性和PKCε膜转位,说明PKCε可能参与大鼠偏头痛中枢敏感化的形成。

PKCε信号通路介导槲皮素拮抗心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的:探讨槲皮素拮抗心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤与蛋白激酶Cε(PKCε)之间的关系。方法:培养新生大鼠原代心肌细胞,构建A/R模型,Western blotting检测槲皮素对PKCε表达水平的调节。检测A/R损伤后各组细胞乳酸脱氢酶活性、肌酸激酶活性、细胞存活率、活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位、线粒体通透性转换孔(mPTP)的开放和细胞凋亡。结果:A/R前72 h加入40μmol/L槲皮素可明显上调心肌细胞PKCε蛋白表达水平,并显著提高细胞存活率,减少ROS产生,维持线粒体膜电位,抑制mPTP开放,减少细胞凋亡(P<0.01)。同时经槲皮素和PKCε抑制剂εV1-2预处理后,则槲皮素的上述保护作用均明显减弱或消失(P<0.01)。结论:槲皮素可以上调心肌细胞PKCε蛋白表达水平,其抗心肌缺血再灌注损伤的保护作用机制可能依赖于PKCε途径。

腺病毒介导的心肌蛋白激酶Cε基因转移导致心肌损害

目的研究腺病毒介导的成年小鼠心肌直接蛋白激酶(PK)Cε基因转移对左心室收缩功能的影响。方法使用标准方法建立表达PKCε基因的重组腺病毒载体。直接注射重组腺病毒到FVB/N和ICR小鼠心肌,对照鼠给予相同剂量空载腺病毒。Western免疫印迹测定PKCε蛋白质表达水平。用非开胸经颈总动脉插管的显微外科技术评价小鼠左心室收缩功能。结果与对照鼠相比基因转移鼠心肌转基因PKCε蛋白质表达水平增加近4倍,基线左心室最大收缩压、最大收缩速率(dP/dt)、-dP/dt明显降低,左心室舒张末压、舒张压明显升高(P<0.01),异丙肾上腺素刺激后左心室dP/dt随剂量递增的依次升高明显抑制(P<0.01),PKCε基因转移鼠心脏质量/体质量比也较对照鼠明显增加(P<0.01)。结论腺病毒介导的、心肌直接的PKCε基因转移诱发了左心室收缩功能降低,导致了心肌肥厚和心力衰竭。

黄芪甲苷诱导NO生成并激活PKCε对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究黄芪甲苷(AsⅣ)对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用,阐明其作用机制。方法:30只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、再灌注模型组、阳性药尼可地尔(10mg.kg-1)组、AsⅣ(5mg.kg-1)组及AsⅣ+氯化白屈莱赤碱(CHE)(3mg.kg-1)组,每组6只,结扎左冠状动脉前降支30min,松扎再灌注120min制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,检测AsⅣ对其血清中LDH、MDA和SOD以及NO的影响,同时光镜下观察心肌细胞病理组织形态学变化,Western blotting法检测心肌细胞胞浆及胞膜PKCε蛋白表达。结果:AsⅣ组与模型组比较,LDH漏出量降低(P<0.05),MDA含量明显降低(P<0.01),SOD活力增强(P<0.01),NO含量增加(P<0.01)。HE染色组织形态学观察,与模型组比较,AsⅣ组心肌细胞形态有明显的改善,炎细胞浸润也有减轻。Western blotting法检测,AsⅣ组心肌细胞胞膜PKCε表达量高于模型组(P<0.05)。CHE减弱了ASⅣ的这种保护作用;与AsⅣ组比较,AsⅣ+CHE组LDH漏出量升高(P<0.05),MDA含量升高(P<0.01),SOD活力降低(P<0.01),PKCε胞膜表达量降低(P<0.05),心肌细胞水肿明显、胞质着色较浅。结论:AsⅣ通过诱导NO的生成对大鼠心肌缺血再灌注损伤产生保护作用,PKCε的激活可能是AsⅣ保护心肌细胞信号传导通路的组成部分。

抑制外周神经元PAR2-PKA/PKCε通路对痛转化模型大鼠痛阈的影响

目的探讨外周神经元蛋白酶激活受体2-蛋白激酶A/蛋白激酶Cε(PAR2-PKA/PKCε)通路在痛转化中的作用,寻找同时干预急性痛和慢性痛的可能方案。方法 SD大鼠随机分为空白组、假诱发组、诱发组、抑制剂1组和抑制剂2组。除空白组和假诱发组,所有大鼠均通过先后足部注射角叉菜胶和前列腺素E2(PGE2)建立痛觉敏化诱发模型。PGE2于角叉菜胶注射后7 d进行足部注射。抑制剂1组和抑制剂2组大鼠于PGE2注射前/后,分别给予PAR2抑制剂。观察角叉菜胶/生理盐水,注射前、注射后5 h、3 d、6 d、7 d 0.5 h、7 d 4 h和7 d 24 h大鼠机械痛阈(PWTs)的变化,检测角叉菜胶注射后7 d 24 h造模侧背根神经节(DRG)中PAR2、蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶(PKCε)表达。结果痛觉敏化诱发模型建立成功。角叉菜胶注射后7 d给予PGE2,显著延长了PGE2诱发疼痛的存在时间,角叉菜胶注射后7 d 24 h假诱发组大鼠PWTs与同期空白组相比差异无显著性(P>0.05),而诱发组大鼠PWTs明显低于同期空白组和假诱发组大鼠(P<0.01)。诱发组大鼠造模侧DRG中PAR2和PKCε表达在角叉菜胶注射后7 d 24 h明显提升,高于同期假诱发组和空白组(P<0.05)。给予PAR2抑制,不论时间均能显著翻转角叉菜胶注射后7 d 24 h,诱发组大鼠由PGE2诱发的疼痛(P<0.05),并抑制DRG中PKCε表达。但,给予PAR2抑制剂不能影响PGE2诱发的急性疼痛和调制DRG中PKA含量。结论抑制PAR2表达能阻断急性痛向慢性痛转化,这可能与其抑制DRG中PAR2-PKCε通路激活有关。但抑制PAR2并不能干预急性痛,这可能是因为DRG中PAR2相关通路未参与急性痛的产生。

磷脂酶Cε基因在膀胱移行细胞癌中表达及其临床意义

目的探讨磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)基因在膀胱移行细胞癌表达及临床意义。方法采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测27例膀胱移行细胞癌和12例正常膀胱对照组中PLCε mRNA表达,分析其与膀胱病理学特征的关系。结果PLCε mRNA在膀胱移行细胞癌的表达显著高于正常膀胱组织(P<0.01),PLCε的表达和膀胱移行细胞癌分期有关(P<0.05)而与分级无关(P>0.05)。结论PLCε基因在膀胱移行细胞癌组织中呈高表达,可能是未来检测膀胱移行细胞癌一种新的有价值的肿瘤标志物,同时也可能成为膀胱肿瘤生物学治疗中一个新靶点。

灯盏花乙素干预缺血再灌注损伤人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子与蛋白激酶Cε的表达

背景:有关灯盏花乙素的研究多集中在神经细胞、神经元及平滑肌细胞上,但对血管内皮细胞的作用研究尚少。目的:观察灯盏花乙素预处理后对人脐静脉内皮细胞缺血再灌注损伤后血管内皮生长因子与蛋白激酶Cε表达的影响。方法:体外培养的人脐静脉内皮细胞,分别设立对照组,模型组和及灯盏花乙素高、中、低剂量组。将人脐静脉内皮细胞予缺氧缺糖3h/复氧糖5或24h;灯盏花乙素高、中、低剂量组分别加1×10-5,1×10-6,1×10-7mol/L灯盏花乙素孵育30min,然后予缺血再灌注处理。实验结束后取细胞裂解液用Westernblot检测血管内皮生长因子、蛋白激酶Cε的蛋白表达。结果与结论:缺血3h再灌注5及24h,较对照组,模型组血管内皮生长因子的表达降低,细胞颗粒部分蛋白激酶Cε的表达明显增加。灯盏花乙素能促进缺血3h再灌注5h人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子的表达,尤其以灯盏花乙素高剂量和中剂量组明显,但对蛋白激酶Cε的表达没有影响。

化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤大鼠PKCδ、PKCθ和PKCε表达的影响

目的探讨化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠蛋白激酶(PK)Cδ、PKCθ和PKCε表达的影响及其神经保护机制。方法以改进后的Zea-Longa线栓法制造局部梗死性脑缺血再灌注模型。随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组,中药高剂量组、中剂量组、低剂量组,以Longa评分法进行神经功能评分,免疫组化法观察PKCδ、PKCθ和PKCε的分布及表达。Western印迹法评测其在各组大鼠缺血侧脑组织中的表达量。结果免疫组化结果显示:与假手术组相比,模型组PKCδ、PKCθ表达升高,PKCε表达降低(P<0.05),与模型组相比,各用药组PKCδ、PKCθ均降低,PKCε表达升高(P<0.05),其中以中药高剂量组及尼莫地平组较为明显(P<0.05)。Western印迹法显示:与假手术组相比,模型组PKCδ、PKCθ表达升高,PKCε表达降低(P<0.05),与模型组相比,各用药组PKCδ、PKCθ均降低,PKCε表达升高(P<0.05),其中以中药高剂量组及尼莫地平组较为明显(P<0.05)。结论化浊解毒活血通络方可能通过降低PKCδ、PKCθ的表达、上调PKCε的表达,降低CIRI的程度。

异丙肾上腺素活化蛋白激酶Cε诱导心肌细胞ERK磷酸化

目的研究异丙肾上腺素(Iso)刺激心肌细胞后是否激活PKCε,探讨直接被cAMP激活的交换蛋白(Epac)在其中的作用及其与ERK信号通路的关系。方法以原代培养的Wistar乳鼠心肌细胞为实验细胞,用β肾上腺素能受体(β-AR)激动剂Iso、Epac激动剂8-CPT、Epac抑制剂Epac R279K(DN)及腺病毒编码兔肌肉cAMP依赖的蛋白激酶抑制剂(Ad.PKI)和PKCε转位抑制肽处理细胞,Western blot检测细胞颗粒部分PKCε及pERK1/2,激光共聚焦显微镜观察PKCε转位情况。结果 Iso引起心肌细胞颗粒部分PKCε增加,PKCε转位于胞核周围。8-CPT增加细胞颗粒部分PKCε(P<0.05)。Epac R279K感染细胞后再予Iso处理,颗粒部分PKCε与对照组相比无增加。Ad.PKI未抑制Iso引起的颗粒部分PKCε增加(P<0.01)。PKCε转位抑制肽阻断Iso诱导的ERK1/2磷酸化。结论心肌细胞中β-AR通过Epac介导以不依赖于PKA的方式活化PKCε并诱导ERK1/2磷酸化。

“环境-遗传-基因互作”模式中磷脂酶Cε1对食管癌易感性的影响

随着全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)和后GWAS研究的深入,越来越多的疾病相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)被发现。近年的研究[1-3]提示,部分疾病相关SNP可导致其所在基因以及相关基因转录和蛋白表达水平发生变化,进一步影响肿瘤的发生和发展,甚至影响肿瘤的转归(预后),这些发现极大丰富了“环境-遗传-基因互作”模式对肿瘤发生、发展和转归影响的新理论;这些SNP可分为增加疾病易感性的SNP和致病性SNP两大类。推测致病性SNP不但影响相关基因的转录和蛋白表达,并且也可能影响驱动基因突变。

吡柔比星通过PLCε-Bcl-2通路抑制膀胱癌细胞增殖

目的探讨吡柔比星对膀胱癌细胞增殖的影响及其作用机制。方法膀胱癌细胞T24和BIU-87分别用0.4、0.8、1.6、3.2mg/L的吡柔比星处理24、48、72h,用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率,qRT-PCR、RT-PCR检测磷脂酶Cε(PLCε)mRNA及凋亡调控基因Bcl-2mRNA的表达,蛋白质印迹法检测PLCε蛋白的表达。将膀胱癌细胞分为空白组、吡柔比星处理组、Ad-shPLCε处理组、吡柔比星联合PLCε干扰腺病毒载体(Ad-shPLCε)处理组,检测并比较各组细胞增殖和Bcl-2蛋白的表达量。结果在膀胱癌细胞T24、BIU-87中,吡柔比星对细胞的抑制率呈浓度、时间依赖性,即随着药物浓度增加、处理时间延长,细胞抑制率升高;吡柔比星促进T24和BIU-87细胞凋亡,并且抑制PLCε和Bcl-2表达。吡柔比星处理组、Ad-shPLCε处理组、Ad-shPLCε联合吡柔比星处理组均能抑制细胞增殖和Bcl-2表达,且Ad-shPLCε联合吡柔比星处理组的抑制作用高于吡柔比星处理组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论吡柔比星能有效抑制膀胱癌细胞的增殖,可能与其抑制PLCε癌基因及下游Bcl-2基因的表达有关。

人IgE Cε3-Cε4蛋白的表达、复性、纯化及初步鉴定

目的获得IgE Fc段的Cε3-Cε4重组蛋白(E34)。方法以RT-PCR技术扩增IgE Cε3-Cε4(E34)cDNA片段,构建原核表达载体。以其转化大肠杆菌BL-21,诱导表达主要以包涵体形式存在的目的蛋白。经复性、纯化后,用Wes-tern blot和ELISA法初步鉴定所获E34蛋白与抗人IgE mAb的结合能力。结果对克隆的E34基因片段测序表明,与已报道的序列相一致。获得的可溶性E34蛋白经SDS-PAGE鉴定显示,其相对分子质量(Mr)同预期的结果相一致。Westernblot和ELISA法进一步证实,E34蛋白能够被鼠抗IgE mAb特异性识别。结论成功地构建了pET28a(+)-E34表达载体,并获得能被抗IgE mAb特异性识别的可溶性蛋白E34,为下一步的工作打下了基础。

PLCε基因通过NF-κB/p65途径抑制肾癌786-0细胞的增殖

目的探讨RNA干扰技术沉默人源磷脂酶Cε(PLCε)基因对肾癌786-0细胞p65核转位的调控,对786-0细胞增殖的影响及其机制。方法用携带PLCεshRNA基因的真核表达质粒pGenesil-PLCε转染786-0细胞,克隆形成实验检测786-0细胞的增殖,RT-PCR检测PLCε、c-Myc和COX-2 mRNA的表达,Western blot检测PLCε、c-Myc、COX-2和p65总蛋白及p65在细胞核的表达,细胞免疫荧光检测p65在细胞核与细胞质的定位。同时应用p65特异的抑制剂BAY11-7082处理786-0细胞,Western blot检测c-Myc和COX-2蛋白的表达。结果转染pGenesil-PLCε质粒的786-0细胞生长明显受抑制;转染pGenesil-PLCε质粒细胞中PLCε、c-Myc和COX-2 mRNA和蛋白表达水平均较对照组pGenesil-NP明显下调(P<0.01),且抑制核中p65蛋白的表达(P<0.01),细胞免疫荧光结果显示转染pGenesil-PLCε质粒组p65在细胞核中的表达较对照组pGenesil-NP明显下降;BAY11-7082抑制c-Myc和COX-2蛋白的表达(P<0.01),且呈时间浓度依赖性。结论沉默PLCε基因后可能是通过抑制p65的核转位及c-Myc、COX-2的表达抑制786-0细胞的增殖。

蛋白激酶Cε对肝癌SK-Hep-1细胞生物学行为的影响

目的:使用小干扰RNA(siRNA)抑制人肝癌SK-Hep-1细胞中蛋白激酶Cε(PKCε)的表达并对抑制效果进行测定,检测沉默后SK-Hep-1细胞增殖和侵袭能力的变化。方法:培养SK-Hep-1细胞,分为PKCε-siRNA组、阴性对照(NC-siRNA)组和未行处理(control)组。采用MTT比色法观察各组细胞增殖能力的变化,采用Transwell法观察各组细胞侵袭能力的变化,Western blotting观察细胞核增殖抗原Ki67、基质金属蛋白酶9(MMP-9)等功能蛋白的表达,萤光素酶报告基因检测NF-κB信号通路的活性。结果:与对照组相比,PKCε-siRNA组PKCεmRNA和蛋白表达水平都明显降低(P<0.01),Ki67和MMP-9蛋白表达水平降低,细胞增殖能力明显降低(P<0.01),PKCε-siRNA组穿过Transwell膜的细胞少于对照组(P<0.01),且NF-κB转录活性下降(P<0.01)。结论:通过siRNA技术降低PKCε表达可抑制肝癌SK-Hep-1细胞增殖及其侵袭能力,其抑制作用可能与抑制NF-κB通路的转录活性有关。

磷脂酶Cε1在1型糖尿病大鼠病理性神经痛中的作用初探

目的观察糖尿病病理性神经痛(DNP)大鼠脊髓磷脂酶Cε1(PLCE1)表达变化及RhoA抑制剂C3胞外酶对其活性影响,阐明PLCE1在DNP发生中的作用。方法24只8周龄、健康雄性SD大鼠随机分为4组(n=6):正常对照组(C组),单纯RhoA抑制剂组(E组),1型糖尿病DNP模型组(DNP组)和RhoA抑制剂干预组(EG组);静脉注射1%链脲佐菌素(STZ 65 mg/kg)用于建立1型糖尿病DNP大鼠模型。对E组和EG组大鼠进行每天1次为期1周的RhoA抑制剂C3胞外酶(10 pg/10μL)鞘内注射治疗;C组和DNP组在相应时间点鞘内给予同等容积的溶剂;应用葡萄糖测定仪测定空腹血糖浓度(mmol/L);采用von Frey细丝法和冷热板测痛仪测定大鼠后爪机械刺激缩足反射阈值(MWT)和热刺激缩足反射潜伏期(TWL)作为痛阈观察指标;Westernblot检测脊髓活化RhoA蛋白(RhoA-GTP)、总RhoA蛋白和PLCE1蛋白表达,用脊髓PLCE1蛋白表达水平和RhoA-GTP/总RhoA比值分别评价PLCE1和RhoA活性。ELISA检测脊髓TNF-α和IL-6含量以评价炎症反应。结果单纯应用RhoA抑制剂C3胞外酶对非DNP大鼠各项检测指标无明显影响;1型糖尿病DNP大鼠脊髓组织RhoA和PLCE1活性均显著增加(P<0.05),TNF-α和IL-6含量明显增多,差异有统计学意义(P<0.05),TWL及MWT显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);C3胞外酶治疗在显著抑制1型糖尿病DNP大鼠脊髓组织RhoA表达(P<0.05)的同时,伴有脊髓PLCE1活性的显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)、炎症因子TNF-α和IL-6生成的明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),并显著缓解1型糖尿病DNP大鼠的机械痛敏和热痛敏。结论PLCE1在1型糖尿病大鼠DNP中发挥重要作用,其活性受RhoA调控。