人IgE Cε3-Cε4蛋白的表达、复性、纯化及初步鉴定

目的获得IgE Fc段的Cε3-Cε4重组蛋白(E34)。方法以RT-PCR技术扩增IgE Cε3-Cε4(E34)cDNA片段,构建原核表达载体。以其转化大肠杆菌BL-21,诱导表达主要以包涵体形式存在的目的蛋白。经复性、纯化后,用Wes-tern blot和ELISA法初步鉴定所获E34蛋白与抗人IgE mAb的结合能力。结果对克隆的E34基因片段测序表明,与已报道的序列相一致。获得的可溶性E34蛋白经SDS-PAGE鉴定显示,其相对分子质量(Mr)同预期的结果相一致。Westernblot和ELISA法进一步证实,E34蛋白能够被鼠抗IgE mAb特异性识别。结论成功地构建了pET28a(+)-E34表达载体,并获得能被抗IgE mAb特异性识别的可溶性蛋白E34,为下一步的工作打下了基础。

Cε3-Cε4蛋白寡核苷酸适配子结合位点的预测与筛选

采用NPDock程序对Cε3-Cε4蛋白与其核酸适配子A1的结合位点进行了预测与筛选,筛选出A1与Cε3-Cε4蛋白结合的关键位点.同时,根据蛋白与DNA片段复合物结合界面中氨基酸残基和碱基统计分析发现,结合界面氨基酸富集碱基G能力最强,富集碱基T和C能力次之.本文建立了以NPDock程序虚拟对接为基础的高效适配子优化方法,为相关研究提供了实验参考.

Cε3-Cε4结合肽筛选及鉴定

为了获得免疫球蛋白E(IgE)特异性结合肽,采用固相筛选法,以Cε3-Cε4为靶蛋白,利用噬菌体随机多肽展示技术进行筛选,4轮筛选后,经ELISA鉴定获得19个阳性单克隆噬菌体,阳性率达38%,测序并翻译后共获得11个结合肽.竞争抑制性实验证明P7,P13,P20与Cε3-Cε4蛋白的结合能力较强,细胞水平分析表明:结合肽P7,P20可阻止IgE与其受体结合.本研究将为进一步探索IgE结合肽生物学功能奠定基础,并为设计治疗变态反应性疾病的小分子药物提供参考.

人Cε3-Cε4基因克隆、表达及纯化复性

利用RT-PCR技术从变态反应疾病患者外周血淋巴细胞中克隆出人Cε3-Cε4基因,将其克隆至原核表达载体pET-17b中,转化大肠杆菌并进行诱导表达,SDS-PAGE后Cε3-Cε4蛋白表达量占细菌总蛋白的30.7%。菌体经裂解、2 mol/L尿素洗涤后,绝大部分杂蛋白被去除,目的蛋白纯度达85.5%。用8 mol/L尿素溶解包涵体,经Ni-NTA柱对变性状态下的目的蛋白进行纯化,并利用降低尿素梯度的方法对纯化的蛋白进行复性,最终目的蛋白纯度为95.3%。Western blotting方法对Cε3-Cε4蛋白进行鉴定,为该蛋白的进一步相关研究奠定基础。

人IgE重链3-4区蛋白的表达、纯化及功能分析

目的通过基因重组的方法表达IgE Cε3-Cε4区,鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的相互作用,并用重组蛋白免疫小鼠制备血清。方法用RT-PCR方法从过敏性疾病病人外周血淋巴细胞调取IgE Cε3-Cε4cDNA片段,克隆至pET28a(+)构建原核表达载体IgE Cε3-Cε4-pET28a(+),将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达IgE Cε3-Cε4区蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白后,用免疫荧光方法鉴定重组蛋白与天然细胞表面受体FcεRⅠ之间的结合能力,并用UniCAP 100全自动分析检测仪对重组抗原进行定量检测与鉴定;用表达蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗鼠血清,用Western-blot法对多克隆抗体进行鉴定。结果成功调取的人IgE Cε3-Cε4区基因与已报道的序列相一致;获得的IgECε3-Cε4区蛋白相对分子质量(Mr)同预期的结果相一致;IgE Cε3-Cε4能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠ受体;通过UniCAP 100全自动分析检测仪能够检测到重组抗原并精确到国际单位;免疫鼠血清多抗能特异性结合天然人血清IgE。结论成功构建了IgE Cε3-Cε4-pET28a(+)表达载体,获得了能被人嗜碱性粒细胞表面的FcεRⅠα亚基特异性识别的IgE Cε3-Cε4区蛋白,并用天然人血清IgE鉴定了多克隆抗体,为下一步单克隆抗体的制备打下了基础。