一种新的CIITA显性负向突变体的构建和功能研究

II类反式激活因子(CIITA)参与MHC II类基因转录表达的调控,本研究采用RT-PCR等分子克隆技术构建含起始密码子和NLS序列,但是删除N和P/S/T结构域的CIITA突变体质粒pCDNA3.1(+)mCIITA,用脂质体转染法将上述突变体及pCDNA3.1(+)空载体转入来源于BALB/c小鼠的1B4.B6细胞株,用流式细胞术和RT-PCR观察I-A分子表达的影响,并通过混合淋巴细胞反应观察C3H小鼠CD4+T细胞对转入突变体及空载体的1B4.B6细胞的免疫应答强度。结果在细胞和分子水平证实pCDNA3.1(+)mCIITA对1B4.B6细胞I-A的表达起明显抑制作用,强阳性克隆抑制率为90%以上。细胞已基本丧失了对受者CD4+T细胞的刺激能力。以上结果为减低同种异体/异种器官细胞性排斥提供了新的思路和手段。

修饰CⅡTA基因抑制异种器官移植中供体猪SLA的表达

目的 构建可抑制猪MHC(SLA)Ⅱ类分子表达的MHCⅡ类分子反式激活因子 (CⅡTA)突变体 ,抑制人CD4+ T细胞对猪细胞株的免疫应答 ,为异种器官的应用研究奠定基础。方法 用PCR、人工合成寡核苷酸、限制性内切酶等技术构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2、含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3突变体。用脂质体转染法将上述 2种突变体及pcDNA3空载体转入猪细胞株PIEC细胞和L2 3细胞。用流式细胞术和RT PCR法观察它们对PIEC/L2 3细胞SLA DR/DQ分子的诱导性和组成性表达的影响。通过混合淋巴细胞反应观察人CD4+ T细胞对转入突变体及空载体后的猪细胞的免疫应答强度的变化。结果 在细胞和分子水平证实pcDNA3mCⅡTA3对PIEC/L2 3细胞SLA DR/DQ的表达起明显抑制作用 ,而pcDNA3mCⅡTA2和pcDNA3空载体无此作用。SLAⅡ类分子受抑制的猪细胞已基本丧失了对人CD4+ T细胞的刺激能力。结论 转染能抑制SLAⅡ类分子表达的突变体使PIEC细胞丧失了对人CD4+ T细胞的刺激能力 ,为异种器官的修饰提供了新的思路。