乙型肝炎病毒前-C区1896和基本C区启动子区1762、1764双突变及YMDD变异对拉米呋啶治疗的影响

目的 :研究乙型肝炎病毒前 - C区 G1896 A突变和基本 C区启动子区 A176 2 T、 G176 4 A双突变对拉米呋啶治疗的影响。方法 :采用直接测序法对服药前、中、后的血清标本的逆转录多聚酶区及前 - C、基本 C区启动子区进行检测。结果 :1前 - C区 G1896 A和基本 C区启动子区 A176 2 T、G176 4 A双突变在出现治疗中病毒学反弹与未出现治疗中病毒学反弹患者间及发生血清学转移与未发生血清学转换患者间差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;2 G1896 A突变在发生 YMDD变异和未发生 YMDD变异的患者间差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,发生 YMDD变异的患者很少伴有 G1896 A突变率低 (9% ) ;3出现治疗中病毒学反弹的患者 YMDD变异增加 ,与未出现治疗中病毒学反弹的患者比较差异有显著性 (P<0 .0 5 )。结论 :前 - C区 G1896 A和基本 C区启动子区 A176 2 T、 G176 4 A双突变对拉米呋啶治疗后出现的治疗中病毒学反弹和血清学转换没有影响 ;在 G1896 A突变株 YMDD变异减少 ;YMDD变异株的出现对治疗后出现的治疗中病毒学反弹有影响 ;YMDD变异可能是加剧肝细胞损伤引起治疗中病毒学反弹的因素之一。

乙型肝炎病毒前C区1896、基本C区启动子区1762/1764变异对拉米夫定抗病毒疗效的影响及其临床意义

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)前C区G1896A变异和基本C区启动子(BCP)区A1762T/G1764A双变异对拉米夫定(LAM)抗病毒疗效的影响及其临床意义。方法收集上海及其周边地区34例慢性乙型肝炎患者,单用LAM或LAM+聚乙二醇干扰素α-2a进行抗病毒治疗共48周,应用Trugene HBV genotyping试剂盒测定分析治疗前(0周)、治疗过程中(24周)、治疗结束时(48周)及随访结束时(72周)RT区YMDD变异;采用HBV基因多态性检测芯片试剂盒测定前C区1896、BCP区1762/1764位点的变异情况。结果在治疗前有9例患者检测出前C区G1896A变异,均为HBVe抗原(HBeAg)阴性慢性乙型肝炎患者;9例前C区G1896A变异患者中7例治疗应答(77.8%,7/9),BCP区A1762T/G1764A变异在治疗应答者与无应答者中差异无统计学意义;3例患者分别在治疗24和48周时检测到YMDD变异,对治疗均无应答。结论慢性乙型肝炎患者治疗前血清HBV DNA变异状态可能影响LAM抗病毒治疗应答及YMDD耐药变异株的复制能力。

HBV基本C区启动子区位点突变及病毒载量与拉米夫定耐药的关系

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）基本C区启动子（BCP）区第1762、1764位点突变及病毒载量与拉米夫定治疗慢性乙型肝炎（CHB）P区第552、528位点变异产生的关系。方法选择CHB且未接受过拉米夫定治疗的患者56例，应用拉米夫定治疗6个月，采用乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片对拉米夫定治疗前后乙型肝炎病毒BCP区第1762、1764位点，P区第552、528位点进行检测，同时对患者治疗前后血清病毒载量进行检测。对比分析BCP区第1762、1764位点突变患者（A组）和未突变患者（B组）应用拉米夫定治疗6个月后，P区第552、528位点变异率，以及治疗前后血清病毒载量水平。结果（1）应用拉米夫定治疗6个月后，A组P区第552、528位点总突变率显著高于B组（P〈O．05）；第552、528单位点以及第552和528双位点突变率两组相比较差异均无统计学意义（P〉O．05）。（2）A组患者治疗前血清病毒载量水平显著高于B组患者（P〈O．05）。（3）产生P区第552、528位点变异患者治疗前血清病毒载量水平，显著高于P区未变异患者（P〈O．05）。结论（1）乙型肝炎病毒BCP区第1762、1764位点突变可增加拉米夫定治疗的耐药率。（2）BCP区第1762、1764位点突变可增加乙型肝炎病毒的复制水平。（3）BCP区位点突变所引起的乙型肝炎病毒大量复制可能是导致拉米夫定耐药率增加的主要原因。

母婴传播母子体内乙型肝炎病毒复制与C区启动子变异的关系

目的 了解母婴传播后母子体内 HBV复制程度差异与 C区启动子变异的关系。方法 对 8对复制程度不同的HBV C区启动子基因进行聚合酶链反应（PCR）,应用TA克隆技术构建重组质粒pGEM—CP,每例患者选2个双酶切鉴定正确的克隆测序并分析。结果 HBV复制状态,子高母低组平均变异数于为5.33±1.53,母为9.33±3.06;子低母高组于为8.25±4.27,母为5.00±1.41。母子低复制者C区启动子变异数及变异位点数明显高于高复制者,变异主要集中在BCP和Kunitz类丝氨酸蛋白序列区域,而同复制状态下母子间差异不大。结论母婴传播后母子体内HBV低复制状态与C区启动子变异有关,可能与机体的生长发育状态无关。

乙型肝炎病毒基因组C区启动子突变位点新型检测方法的建立、验证及初步应用

目的 利用错配扩增和荧光PCR技术,建立一种针对乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）基因组C区启动子（basal core promoter,BCP）1762/1764突变位点的新型检测方法,并对该方法进行验证及临床评价。方法 根据NCBI登录的HBV A-H型基因序列（以GenBank号为AB033556.1的C基因型作为标准参考序列）合成野生型和突变型标准品序列,测序后连接至pMD-18T载体上,构建质粒标准品,设计引物、探针及合适的突变检测体系,确定检测的线性范围;对建立的方法进行灵敏度、重复性、特异性、稳定性验证;分别用本实验建立的ARMS-PCR法和基因Sanger测序法（金标准）检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本的基因位点是否发生突变,并分析ARMS-PCR法的灵敏度和特异度。结果ARMS-PCR法能检测1 × 10^2- 1 × 10^9 copies/ml的野生型和突变型质粒;野生型和突变型样本检测的Ct差值（驻Ct）在7以上,且能检出最低达1%突变含量的混合质粒和样本;该方法灵敏度较高,重复性、特异性、稳定性良好;其检测132份慢性乙型肝炎患者血液样本1762/1764位点突变阳性率为41.7%,明显高于Sanger测序法检测结果（P〈0.05）。结论 建立的ARMS-PCR法能很好地用于评估乙肝患者患肝癌的风险,且较Sanger测序法检测精度更高,更适合于临床推广。

慢性乙型肝炎患者YMDD变异合并前C/C区启动子变异的临床研究

目的探讨慢性乙型肝炎患者中拉米夫定诱导的 YMDD 变异和前 C 区1896位核苷酸以及 C区启动子1762和1764位核苷酸变异的检出率及其临床意义。方法采用基因芯片技术检测拉米夫定治疗6个月以上的122例慢性乙型肝炎患者血清中前 C 区1896位以及 C 区启动子1762和1764位核苷酸变异发生率。结果 122俐慢性乙型肝炎患者中检出40例 YMDD 变异阳性患者,检出率为32.8%。发生 YMDD变异后,HBV DNA 反跳,ALT 和 AST 增高,差异有统计学意义(P<0.01)。YMDD 变异阳性患者前 C 区1896位和 C 区启动子1762和1764位核苷酸变异检出率显著高于无 YMDD 变异的慢性乙型肝炎患者,差异有统计学意义(P<0.01)。YMDD 变异阳性伴前 C 区1896位以及 C 区启动子1762和1764位核苷酸变异患者与无前 C 区1896位以及 C 区启动于1762和1764位核苷酸变异的 YMDD 变异阳性患者比较,病情容易加重.易发展为重型肝炎或肝硬化,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论拉米夫定诱导的 YMDD 变异患者容易发生前 C 区1896位/C 区启动子1762和1764位核菅酸变异,但与病情加重和预后无相关性。

原发性肝癌患者乙型肝炎病毒前C区联合基本核心启动子变异的分析

目的:研究原发性肝癌患者乙型肝炎病毒前C区联合基本核心启动子变异情况及与基因型的关系。方法:收集乙型肝病毒感染者血清132份,HBVDNA均阳性,用半巢式聚合酶链反应扩增HBV前C及C基因部分片段,产物纯化后直接测序,检测前CA1896联合BCPT1762/A1764变异。用S基因PCR-RFLP方法确定HBV基因型。结果:乙型肝炎病毒前C区联合基本核心启动子变异在原发性肝癌组的阳性率为41.18%(14/34),显著高于慢性肝病组的11.22%(11/98)(P<0.01)。前C A1896联合BCP T1762/A1764变异在B基因型检出率与C基因型相比,差异无显著性(P>0.05)。结论:乙型肝炎病毒前C区联合基本核心启动子变异与原发性肝癌关系密切,与基因型无相关性。

慢性HBV感染者HBV前C区/基本核心启动子区基因突变与临床应用

目的:探讨2010年10月至2013年6月来我院门诊及住院慢性HBV感染者中HBV前C(Pre C)区/基本核心启动子(BCP)区基因突变与其病程进展的相关性。方法:165例慢性HBV感染者血清生化指标检测,血清HBV DNA含量和HBe Ag定性检测,HBV Pre C区/BCP区突变率比较,分析Pre C区l896、BCP区1762/1764变异在HBV携带者(As C)、慢性乙型肝炎(CHB)和慢性乙型肝炎肝硬化(CHB-LC)患者中的分布。结果:血清生化指标在慢性HBV感染者病程发展中呈现相关性。与As C组比较:CHB组、CHB-LC组患者血清ALT、AST、AFP、TBA水平升高,差异有显著性意义(p<0.01),呈显著正相关,而TP、Alb、A/G水平降低,差异有显著性意义(p<0.05),呈负相关。HBe Ag(+)、HBe Ag(-)的标本中,BCP的突变率高于前C区突变率,差异有非常显著性意义。BCP区1762/1764双突变的突变率高于Pre C1896突变率。As C、CHB、CHB-LC 3组患者Pre C A1896、BCP区1762/1764变异率依次升高,与As C组比较,CHB组差异有显著性意义(P<0.05);CHB-LC组差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论:对165例慢性HBV感染者观察,HBe Ag(+)/HBe Ag(-)患者及其病程不同发展阶段,Pre C/BCP出现相关联的突变率。特别需要注意的是HBe Ag(-)的慢性HBV感染者BCP区的突变率高于Pre C区的突变率,需要慎防HBV复制的危害性。HBV Pre C区/BCP区突变率可以预测到慢性HBV感染者病情的发展程度,对临床此类患者的研究具有重要意义。

ABCA1基因启动子区-477C/T单核苷酸多态性在中国汉族正常人群中的分布及对血脂的影响

目的研究ATP结合盒转运子A1(ABCA1)基因启动子区-477C/T单核苷酸多态性(SNP)在中国汉族正常人群中的分布及其对血脂的影响。方法用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)检测113例中国汉族正常人ABCA1基因启动子区-477C/T SNP三种基因型在正常人群中的分布及其与临床指标的关系。结果ABCA1基因启动子区-477C/T SNP存在于中国汉族正常人群中;其基因型分布为:CC基因型37.2%(42例),CT基因型46.9%(53例),TT基因型15.9%(18例)。三种基因型间比较,TT基因型血高密度脂蛋白水平明显低于CC基因型(P<0.05),而总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、体重指数等指标在三种基因型间差异无显著性(P>0.05)。结论在中国汉族正常人群中,TT基因型可明显影响血浆高密度脂蛋白水平。

醛糖还原酶基因启动子区C(-106)T多态与糖尿病肾病的相关性

对2型糖尿病伴有糖尿病肾病患者(DN)70例、不伴DN患者64例和85例正常对照研究显示,醛糖还原酶启动子区C(-106)T的CC基因型是中国北方汉人发生DN的危险因子。

护骨素基因启动子区T950C多态性与2型糖尿病合并骨质疏松症的关系

目的探讨护骨素(OPG)基因启动子区T950C的多态性与2型糖尿病(T2DM)合并骨质疏松症的关系,了解T2DM合并骨质疏松症与遗传相关的易感基因。方法(1)使用聚合酶链反应技术,检测T2DM不合并骨质疏松组(A组),T2DM合并骨量减少组(B组),T2DM合并骨质疏松组(C组),OPG基因T950C的基因型,分别分析3组的OPG基因T950C多态性;(2)比较3组人群性别、体重指数、年龄、血压、体重、糖化血红蛋白、身高、血脂、空腹血糖、睾酮、雌激素、维生素D等临床指标;(3)比较OPG基因T950C的基因型间不同部位的骨密度差异;(4)通过Logistic回归分析了解T2DM合并骨质疏松患者的独立危险因素。结果(1)TC型是T2DM和T2DM合并骨质疏松症人群OPG基因T950C的主要基因型;(2)3组OPG基因T950C基因型的频率及等位基因频率的差异均无统计学意义(P>0.05);(3)3组患者体重、年龄、身高、BMI、比较,差异有统计学意义(P<0.05),且各组间相互比较,差异有统计学意义(P<0.05);(4)OPG基因T950C的3种基因型比较,各部位的骨密度均无差异(P>0.05);(5)回归分析显示:年龄、吸烟可进入回归方程,而OPGOPG基因T950C的基因型未进入回归方程。结论(1)TC型是T2DM和T2DM合并骨质疏松症患者OPG基因T950C的主要基因型;(2)OPG基因T950C的基因型可能不是T2DM及T2DM合并骨质疏松症的易感基因;(3)吸烟和年龄是T2DM合并骨质疏松患者的独立危险因素。

乙型肝炎病毒前C区/C基因启动子变异研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)前C区(PreC)和C基因启动子(C promoter)变异与疾病关系密切,多年来一直是研究人员关注的焦点.本文就近年来前C区和C基因启动子变异的研究进展综述如下.

尘螨变应性鼻炎与T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3(Tim-3)启动子区-882T>C基因多态性的研究

目的探讨T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3启动子区-882T>C基因多态性与尘螨变应性鼻炎的关系。方法运用多聚酶链反应技术检测88例尘螨变应性鼻炎及102例正常人Tim-3启动子区-882T>C基因多态性。结果尘螨变应性鼻炎组Tim-3启动子区-882T>CC/C、C/T、T/T表型频率分别为:0.9773、0.0227、0,对照组分别为,0.9804、0.0196、0;尘螨变应性鼻炎组Tim-3启动子区-882T>C、Tim-3启动子区-882T>C基因频率分别为:0.9886、0.0114。对照组分别为:0.9902、0.0098,Tim-3启动子区-882T>C各种基因型频率在患者组与正常对照组之间的差异无显著性(P>0.05)。结论广东汉族人群Tim-3启动子区-882T>C存在单核苷酸多态性变异,Tim-3启动子区-882T>C基因多态性与尘螨变应性鼻炎无明显相关。

慢性肝炎病毒C基因启动子(BCP)变异与干扰素应答的关系

为了探讨干扰素治疗慢性乙型肝炎的疗效与慢性乙型肝炎病毒C区启动子 (BCP)变异之间的关系 ,对 89例HBVDNA阳性的慢性乙型肝炎患者 ,应用错配PCR -RFLP分析技术结合直接序列分析 ,共检出 47例BCP变异株 ,其中 2 4例曾应用干扰素治疗 ,野生株 2 1/4 2例应用干扰素治疗。 2 4例HBVC区启动子变异株对干扰素治疗有效 12例 ;野生株 2 1例 ,对干扰素有效 18例 ,二组相比差异有显著性。野生株组的ALT复常 ,HBVDNA阴转率高于变异株组 (p <0 .0 5 )。而治疗组中变异株组的野生株转化率为 38 9%明显高于对照组 (5 0 % ) ,差异显著 (p <0 .0 5 )。混合感染的病例 ,干扰素治疗后有变异株去优势化积累趋势。提示干扰素治疗不会诱发BCP变异的发生 ,但有BCP变异的病例可降低干扰素的疗效 ,同时也说明变异株对干扰素治疗有反应 。

广东汉族人群Tim-3启动子区-1541C〉T单核苷酸多态性分析

目的了解广东汉族人群Tim-3启动子区-1541C〉T单核苷酸多态性的分布特点。方法应用聚合酶链反应技术对广东汉族健康人群外周血单个核细胞DNA的Tim-3启动子区-1541C〉T基因进行扩增，以BSAJ Ⅰ进行限制性内切酶酶切图谱分析，计算其C／C、C／T和T/T基因型频率和C、T等位基因频率，并结合文献和湖北汉族人群进行地区间的分析比较。结果对169例广东汉族健康人群进行了检测，其Tim-3启动子区-1541C〉T位C／C、C／T和T/T基因型频率分别是0．935、0．053和0．012；Tim-3启动子区-1541C〉T位C，T基因频率分别为：0．962、0．038。结论广东汉族人群Tim-3启动子区-1541C〉T位存在单核苷酸多态性变异，广东汉族人Tim-3启动子-1541C〉T基因的分布与湖北汉族人群的分布无明显差异。

乙型肝炎病毒基本核心启动子和前C基因序列分析

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子(BCP)区及前C(PreC)区基因的变异情况,并且分析其发生频率、分布规律及其与临床病情的关系。方法应用套式PCR扩增nt1660-1935的HBV DNA片段及PCR产物直接测序的方法检测BCP区及Pre-C区基因的变异情况。结果130例乙型肝炎患者标本中,BCP区nt1762/nt1764发生双突变者75例(57.69%),Pre-C区nt1896发生突变者20例(15.38%),并且这两种突变在重型肝炎组(75.00%)及肝硬化组(72.22%)所占比例均明显高于慢性肝炎组(52.56%);此外,在BCP区及Pre-C/C区还发现了一些突变频率较高的其他突变位点(如nt1753,nt1766,nt1846,nt1899,nt1915),其中nt1753突变仅发生于有nt1762/1764双突变的患者,与重型肝炎及肝硬化的发生有一定关系;在BCP区有4处核苷酸突变共存者10例,其中重型肝炎组(12.50%)及肝硬化组(13.88%)所占比例明显高于慢性肝炎组(5.12%)。结论HBV BCP区nt1762/nt1764双突变和Pre-C区nt1896突变与肝炎的活动、重型化及肝硬化的发生有关;BCP区其他位点的突变共存对肝炎病情的进展也有重要影响。

中国献血人群感染乙型肝炎病毒PreC/BCP区的新变异

目的了解中国献血人群感染乙型肝炎病毒(HBV)基因组的PreC/BCP区变异特征。方法从参加REDS-Ⅱ中国项目的 5家血液中心(或中心血站)收集的HBsAg阳性标本中选取245份,提取HBV DNA,根据HBVDNA PreC/BCP区保守序列设计引物,采用巢式PCR法扩增HBV DNA的PreC/BCP区,双向测序后用Clustal X软件将其序列与标准株序列比对,分析其变异特征,用SPSS 11.0统计软件分析其变异与献血者人口地理特征和血清学特征的关系。结果 245份献血者标本中有228份成功扩增了HBV PreC/BCP区,其中16例(7.02%)发现了1825～1 826位核苷酸之间的片段缺失或插入,突变标本中仅1例HBeAg阳性,其余均为阴性,突变标本的病毒载量明显高于未突变标本。结论在中国献血人群中发现感染HBV PreC/BCP区的1种新变异,它可能与抑制HBeAg的表达和促进病毒复制有关。

乙型肝炎病毒核心启动子缺失突变的初步观察

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)e抗原阴性患者HBV核心基因启动子变异方式。方法自5例慢性HBV感染者血清中分别提取HBVDNA,应用多重PCR法鉴定其基因型。PCR扩增X基因序列,克隆入pMD19T载体,共挑选23个克隆测序,与已知HBV基因相应序列比较该患者体内HBV基因变异程度。结果 5例患者中3例基因型分别为B、C和B/C混合型,2例患者通过现行多引物方法无法分型。16个(16/23,69.6%)克隆在X基因下游出现大段缺失突变,其中15例缺失长度为234bp,1例为245bp。缺失突变区域包括C基因启动子区,并导致前-C区起始密码子ATG编码缺失,这种缺失突变在5例患者中均被检出。结论 CP/HBeAg起始密码子缺失突变可能是HBeAg阴性慢性乙型肝炎的一种变异模式。

慢性乙肝病毒B亚型感染儿童不同HBeAg状态下CP基因变异测定

目的了解HBV基因型B/adw2型的慢性HBV感染儿童不同血清HBeAg状态下HBVC区启动子基因的变异。方法选择HBV基因型为B型/血清型adw2的慢性HBV感染儿童64例,按血清HBeAg不同状态分为血清e抗体阳性组(n=34)和e抗原阳性组(n=30)2组,以HBVDNA为模板行PCR反应扩增S区序列(确定HBV基因型)及C区启动子(CP)基因片断,CP基因片断经胶回收纯化后,应用T-A克隆技术构建重组质粒pGEM-CP,经蓝白斑筛选,阳性克隆以凝胶电泳、双酶切及PCR验证后将鉴定正确的克隆测序,将测序结果与Entrezdata-base中血清亚型及基因型相同的HBV序列相比较并进行分析。结果S区基因测序结果证实64例儿童感染的HBV基因型均为B型/血清型adw2。CP基因测序结果证实2组均有CP基因变异,血清e抗体阳性组CP变异率(29.41%)高于e抗原阳性组(6.67%)(P<0.05)。e抗体阳性组有4个变异热点,而e抗原阳性组无变异热点。结论慢性乙肝病毒B亚型感染儿童存在CP基因变异,且可能与e抗原血清转换有关。