稳定表达CD123-CLL1双基因白血病细胞株的构建及鉴定

目的:构建稳定表达CD123-CLL1的慢病毒载体及急性髓系白血病细胞株,为研究CD123、CLL-1在白血病中的作用及以CD123和CLL-1为靶点的治疗方法提供一种体外模型。方法:通过合成CD123及CLL-1序列及PCR同源重组的方式构建慢病毒重组质粒,通过3质粒包装系统对慢病毒质粒载体进行包装,收集慢病毒上清液后采用定量PCR法测定病毒滴度。收集白血病K562细胞株,使用病毒上清液对其进行感染,通过嘌呤霉素筛选以获得稳定表达目的基因的白血病细胞系,采用RT-PCR和流式细胞术检测CD123和CLL-1的表达水平。结果:经琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定,成功构建了慢病毒载体,且经过定量PCR法检测显示,收集后的病毒上清液病毒滴度高达5.81×10^(8)IU/ml。白血病K562细胞株经过感染及通过嘌呤霉素分选后获得阳性表达细胞系,RT-PCR法证实CD123和CLL-1的m RNA高表达,流式细胞术证实了CD123及CLL-1的表达明显高于对照细胞。结论:成功构建了表达CD123-CLL-1的慢病毒载体,同时成功获得了能够稳定表达CD123及CLL-1的K562白血病细胞株。

靶向CLL-1嵌合抗原受体T细胞的构建及其功能验证

目的探索开发一种靶向CLL-1的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)并验证其功能。方法通过流式细胞术检测急性髓系白血病(AML)细胞系和AML原代细胞CLL-1靶点的表达水平。构建CLL-1 CAR载体并制备出相应慢病毒,感染激活后T细胞生产出CAR-T细胞,并通过体外和体内实验验证CLL-1 CAR-T细胞的功能。结果AML细胞系和原代AML细胞中均表达CLL-1。制备的CLL-1 CAR-T细胞转导率为77.82%,在AML细胞系以及AML原代细胞中,CLL-1 CAR-T细胞能明显特异性杀伤表达CLL-1的靶细胞系和原代肿瘤细胞。相对于未转导的T细胞,CLL-1 CAR-T细胞在杀伤靶细胞和原代肿瘤细胞时分泌IL-6、IFN-γ等细胞因子水平更高(P值均<0.001)。在AML人源性异种移植小鼠模型中,相对于未转导的T细胞,CLL-1 CAR-T细胞表现出有效的抗白血病活性并延长小鼠存活时间[未达到对22(95%CI 19~24)d,P=0.002]。结论靶向CLL-1的CAR-T细胞成功开发并具有较好的肿瘤杀伤作用。

PD-L1过表达对CLL-1 CAR-T细胞抗急性髓系白血病作用的影响

目的:探讨程序性死亡受体配体1(PD-L1)对CLL-1 CAR-T细胞抗急性髓系白血病(AML)作用的影响。方法:通过构建PD-L1表达载体、制备慢病毒、转导、单克隆筛选技术获得稳定表达PD-L1的THP-1单克隆细胞株(THP1-PDL1),然后以前期制备的CLL-1 CAR-T细胞为效应细胞,以THP-1、THP1-PDL1单克隆细胞株作为靶细胞,分别通过LDH检测、CBA法、CFSE法评价PD-L1过表达对CLL-1 CAR-T细胞裂解功能、炎性因子释放、细胞增殖等功能的影响。结果:①成功制备了PD-L1慢病毒,并筛选获得了稳定表达PD-L1的THP1-PDL1单克隆细胞株,流式细胞术及PCR验证成功。②PD-L1过表达抑制了CLL-1 CAR-T细胞裂解THP-1细胞的能力;效靶比为10∶1时,CLL-1 CAR-T细胞对THP1-PDL1细胞的杀伤效率明显低于对THP-1细胞的杀伤效率[(15.70±9.90)%对(51.95±2.52)%,P<0.05]。③PD-L1过表达减弱了CLL-1 CAR-T细胞释放细胞因子的能力[与THP1-PDL1细胞共培养时对与THP-1细胞共培养时:IFN-γ(115.66±3.13)pg/ml对(1708.16±26.76)pg/ml,P<0.05;IL-6(17.37±0.72)pg/ml对(124.92±4.26)pg/ml,P<0.05;IL-10(5.69±0.13)pg/ml对(124.12±3.02)pg/ml,P<0.05];同时抑制了CLL-1 CAR-T细胞的增殖能力。结论:成功构建了表达PD-L1的THP1-PDL1单克隆细胞株,同时证实了PD-L1过表达对CLL-1 CAR-T细胞抗AML的不利的影响,为通过PD-1/PD-L1通路调控CLL-1 CAR-T细胞功能提供了一定的理论基础。