丙型肝炎病毒感染与HCC相关性的研究

目的 探讨丙型肝炎病毒 (HCV)感染与肝细胞癌发生的关系。方法 用聚合酶链反应 (PCR)对淮南地区 92例肝癌、117例肝硬化和 10 0例肝癌切除的肝组织标本进行HCV RNA检测 ,并以限制性片段长度多态性分析对其中 89例HCV RNA阳性血清进行了HCV基因分型。结果 肝癌组HCV感染率 2 9 3% ,肝硬化组HCV感染率 2 6 5 % ,肝组织标本组HCV感染率 31 0 % ;各组均以HCVⅡ型为主(6 5 2 % ) ,HCVⅢ型次之 (31 5 % )。结论 淮南地区肝癌的诱发与HCV感染密切相关 ,HCVⅡ型在本地区HCV相关性肝癌和肝硬化的发生中可能起主要作用。

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白 (core)反式激活的新型靶基因。方法 以HCV核心蛋白表达质粒pcD NA3 1(- ) core转染HepG2细胞 ,以空载体 pcDNA3 1(- )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选出来的基因 ,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对及电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染 pcDNA3 1(- ) core的HepG2细胞提取总RNA ,以RT PCR技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为 2 0 0 1nt,编码产物由 6 6 7aa组成 ,并测序证实 ,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册 ,注册号为AY0 3835 9。结论 发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1。

戊型肝炎病毒Ch-S-1株全长体外转录载体的构建及表达初步研究

目的:构建出HEV Ch-S-1株的全长c DNA克隆,并转染至Hep G2细胞并对其表达进行初步研究。方法:利用重叠PCR方法获得HEV Ch-S-1株全长PCR产物;构建体外转录载体p KS-HEV,成功获得HEV基因组RNA,并转染至Hep G2细胞,通过RT-n PCR、套式PCR和间接免疫荧光实验检测病毒的表达。结果:成功构建了HEV基因组全长c DNA体外转录载体p KS-HEV,并证明了该c DNA克隆在Hep G2细胞中成功进行了表达。结论:成功构建了HEV Ch-S-1株全长体外转录载体p KS-HEV,并对其表达进行了初步研究,为将来在分子水平上研究HEV及研发疫苗提供了一些实验基础。

丙型肝炎病毒核心蛋白对细胞凋亡的影响

目的考察丙型肝炎病毒核心蛋白对细胞凋亡的影响,以期从另一个角度研究丙型肝炎病毒可能的致癌机理.方法应用流式细胞仪检测 HepG2-C 细胞和 HepG2-CMV 细胞对氨甲喋呤(MTX 10mg/L)和去血清的耐受.并进一步检测凋亡相关基因及产物的表达.结果应用流式细胞仪检测 HepG2-C 细胞和 HepG2-CMV 细胞对氨甲喋呤(MTX 10mg/L)的耐受,结果 HepG2-C 细胞24小时和48小时的凋亡率分别为5.1%和9.6%,而 HepG2-CMV 细胞为6.8%和16%.而去血清2,4,6天的 HepG2-C 细胞凋亡率分别为6.6%,9.4%,11.5%,而 HepG2-CMV 细胞分别为11.4%、13.5%、16.1%.表明表达丙肝病毒核心蛋白的细胞 HepG2-C 较转染空载体的细胞 HepG2-CMV 耐受凋亡.在进一步分子机理的探讨中发现 HepG2-C 细胞 P53,C-myc,Bcl-2表达增加,而 Fas 表达减低,转录水平也发生同样的变化.结论丙肝病毒核心蛋白可能通过调节基因转录与表达,抑制某些因素引起的细胞凋亡.

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A结合蛋白

目的 筛选丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS4A结合蛋白 ,为HCV致病机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体展示技术 ,以HCV非结构蛋白NS4A作为固相筛选分子 ,对T7噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 5轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析。结果 噬菌体经富集后 ,从随机挑选的 12个克隆中得到 2个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过序列同源性分析 ,确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活蛋白激酶 5 (MAPKAPK5 )。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HCV非结构蛋白NS4A的结合蛋白 ,为进一步研究HCV的致病机制奠定了良好的基础。

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法 以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原 ,利用抗原 抗体亲和性结合的原理 ,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验 (ELISA)和DNA序列分析 ,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体 ;用该抗体对 772 1转染全长HCVcDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明 ,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合 ;免疫组化结果表明 ,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原 ,与正常肝细胞无交叉反应。结论 此法制备单链抗体方法简便 ,周期短 ,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 (抗 Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论 HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B(HCV NS5B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交(SSH)分析.随机挑取克隆进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到35个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析,显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS5B反式激活靶基因.结论:成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.

丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定

目的 :构建HCVns5b基因的重组原核表达质粒 ,并获得NS5B蛋白的高效表达 ,为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件 .方法 :利用PCR技术扩增HCVns5b基因 ,XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上 ,转化大肠杆菌JM 10 9菌株 ,获得阳性重组质粒pRSETA ns5b ,阳性质粒转化BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE和WesternBlot电泳进行鉴定 ,并以薄层扫描分析对其定量 .结果 :成功构建了HCVNS5B蛋白表达载体 pRSETA ns5b,经诱导明显表达出6His NS5B融合蛋白 ,表达产物主要以包涵体形式存在 ,表达量占菌体蛋白 2 5 % ,Western Blot结果显示表达蛋白保持活性 .结论 :HCVNS5B蛋白在体外得到了有效表达 .

HCVC基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-C的构建、鉴定及表达

目的构建能表达HVC基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCVC基因的腺病毒载体做准备。方法用分别含有BgⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVC区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCVC区基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd,CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-C通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定,以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-C在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd,HCV-C插入片段为HCVC区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论构建的质粒pAd.HCV-C可以在7721细胞中瞬时表达HCVC区基因,为包装表达HCVC基因的腺病毒载体奠定了基础。

抗HCV不同位点核酶细胞内对病毒基因的抑制作用

为探讨核酶细胞内对HCV基因表达的抑制作用 ,笔者设计合成了两个针对HCV 5′NCR2 13位点和C区 498位点的锤头结构核酶 ,并插入真核表达载体 pcDNA3。应用WISH nc转基因细胞模型 ,通过脂质体法转染核酶表达载体 ,经发光检测仪测定荧虫素酶报告基因的表达变化以反应病毒基因的抑制率。结果显示 ,核酶2 13和核酶 498均能在细胞内降低荧虫素酶的表达 ,转染后 7日内的抑制率为 42 .94%～ 6 7.81%。提示增加核酶作用位点可防止病毒基因突变后的切割失效 。

肾移植术后糖尿病的发病率及丙型肝炎在其发病过程中的作用

目的:肾移植术后糖尿病已成为影响患者术后短期及长期存活率的一项严重并发症。总结肾移植术后糖尿病的发病率及独立危险因素,并分析丙型肝炎病毒感染在其发病过程中的可能作用。方法:选择2000-01/2004-01在首都医科大学附属北京友谊医院行肾移植,术后服用他克莫司的患者58例,均知情同意。实验分组:①预防组(n=15):移植术前处于术前免疫功能高危状态。他克莫司起始剂量为10～12μg/L。②治疗组(n=25):移植术后出现耐激素性排斥反应,需要抗体治疗。他克莫司起始剂量为10～15μg/L。③转换组(n=18):移植术后出现高血脂、顽固性高血压、慢性移植肾功能减退等情况,传统药物疗效欠佳,需将环孢霉素A转为他克莫司。他克莫司起始剂量为8～10μg/L。进行随访观察,分析3组患者服用他克莫司1年内出现的肾移植术后糖尿病的发病率及丙型肝炎病毒感染的发病率。结果:58例患者全部进入结果分析。①58例患者中肾移植术后糖尿病的发病率为12.08%,服用他克莫司后出现肾移植术后糖尿病的平均时间为52d;丙型肝炎病毒感染的发病率为15.52%,丙型肝炎病毒感染患者中肾移植术后糖尿病的发病率高于非丙型肝炎病毒感染患者(44.44%,6.12%,P=0.001)。②丙型肝炎的发病率3组间差异无显著性意义(P>0.05);预防组及治疗组移植术后糖尿病发病率显著高于转换组(20%,16%,0%,P<0.05)。③多变量统计分析结果显示,在肾移植术后2个月内服用他克莫司的患者,丙型肝炎病毒与他克莫司的剂量是导致肾移植术后糖尿病的独立危险因素;丙型肝炎病毒感染患者出现肾移植术后糖尿病的危险性比非丙型肝炎病毒感染患者高出8.3倍,他克莫司浓度每增加1μg/L,患者出现肾移植术后糖尿病的危险性将增加12%。结论:肾移植术后服用他克莫司的患者肾移植术后糖尿病的发病率与丙型肝炎病毒感染密切相关。

自身免疫现象与慢性丙型肝炎的临床比较研究

目的 :探讨慢性丙型肝炎患者血清中自身免疫性抗体的检出与疾病的相关机制。方法 :以间接免疫荧光法检测 5 4例慢性丙型肝炎患者血清中抗核抗体 (ANA) ,免疫斑点法检测血清多肽抗体谱 (ENA谱 ) ,以散射免疫比法检测血清中类风湿因子 (RF)。以 2 0例慢性乙型肝炎为病人对照 ,2 0例体检健康者为正常对照。结果 :慢性丙型肝炎伴ANA、ENA谱、RF(IgM )阳性率均显著高于正常对照组 (P <0 0 1) ,也显著高于慢性乙型肝炎组 (P <0 0 1) ,其中RF的检出阳性率最高 (2 6/5 4) ,ENA谱中以抗SS B或抗SS A阳性为主要反应 (15 /17)。结论 :慢性HCV感染者普遍存在自身免疫现象 。

HGV/GBV-C与HCV混合感染者外周血单个核细胞及肝脏中相关病毒负链RNA的检测意义

目的自从建立起甲、乙、丙、丁、戊5种肝炎病毒的病原学诊断之后,仍有少部分肝炎患者的病因得不到明确,因此不少学者试图探索是否还有新型肝炎病毒的存在,并进行了大量的流行病学和实验诊断的研究,认为的确存在可经肠道外传播并引起人类肝炎的致病因子,目前关于庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)的致病性和组织嗜性尚无结论性资料我们研究了HGV/GBV-C与HCV混合感染者PBMC和肝脏中HGV/GBV-C复制中间体(负链RNA)的存在状况。方法应用逆转录巢式PCR技术,检测了32例肝炎患者PBMC和肝脏中HGV/GBV-C和HCV正负链RNA。结果 26例HGV/GBV-C与HCV混合感染者PBMC和肝脏中均未检测到HGV/GBV-C负链RNA;而在9份PBMC和15份肝脏标本中检出HGV负链RNA。结论 HGV/GBV-C与HCV混合感染时,在PBMC和肝脏中尚未发现该病毒复制的征据,提示在肝炎病毒混合感染患者中,PBMC和肝脏可能不是HGV/GBV-C的复制场所。

丙型肝炎疫苗的研究现状

丙型肝炎在全世界广泛流行[1],全球有2～3亿的慢性HCV感染者,亟待研制有效的丙肝疫苗.然而,丙肝疫苗的研制尚面临诸多困难.本文就丙型肝炎疫苗的研究现状及相关的免疫学进展作一综述. 1 HCV与机体免疫应答 体液免疫应答在保护机体免受病毒的攻击中发挥着重要作用,包括与HCV同属的黄热病毒[2]、登革热病毒[3]、tickbone脑炎病毒[4]等的疫苗设计均着力于诱生机体的中和抗体,接种后机体均能产生具有中和作用的包膜抗体,并能抵抗随后相应病毒的攻击.然对HCV而言,目前尚不能确定其中和抗体表位[5].有研究表明,HCV-E2区的高变区(HVR1)含有具有中和作用的B细胞表位[6],并发现HCV-E2蛋白能与细胞上的CD81分子结合(CD81被认为是感染肝细胞的HCV受体)[7].

应用荧光定量PCR检测血清中HCV RNA

目的 :探讨荧光定量PCR(FQ PCR)法检测血清中丙型肝炎病毒 (HCV)含量的敏感性、特异性。方法 :采用FQ PCR和逆转录巢式PCR同步检测 76份HCV抗体阳性血清标本 ,并对两种方法的检测结果进行对照比较。结果 :FQ PCR定量HCVRNA拷贝数在 10 2 ～10 6拷贝·μl-1,其中低于 10 3 拷贝·μl-1占 2 0 .93 % ,10 3 ～ 10 5拷贝·μl-1占 60 .47% ,高于 10 5拷贝·μl-1占 18.60 %。 76份HCV抗体阳性血清中 ,巢式PCR检测阳性为 45份 ,FQ PCR检测阳性为 43份 ,二者相对符合率为 97.3 7%。结论 :FQ PCR检测HCVRNA与常规定性巢式PCR特异性、敏感性基本一致。

酵母双杂交技术筛选克隆HCV核心蛋白结合蛋白基因1

目的克隆与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞中的未知蛋白基因。方法应用酵母双杂交系统3.构建HCV核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出30个阳性克隆,对既能在4缺营养缺陷培养基上生长(SD/-Trp-Leu-Ade-His)又能在涂有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养平皿上长出蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后进行测序,进行生物信息学分析.将HCV核心蛋白基因分为大、中、小三段,与所克隆的未知功能基因回交,以证实其相互作用的部位。结果分析的结果显示,其中1号克隆的测序结果与GenBank中的1个未知功能序列有99％的同源性,初步证明了此基因与HCV核心蛋白有结合活性(GenBank号:AY032593).HCV核心蛋白的全长、2/3,1/3三段,回交显示三段均能在酵母中与此未知基因具有结合作用。结论 HCV核心蛋白结合蛋白肝细胞基因克隆成功,核心蛋白与此未知基因的作用部位应是氨基端.此项研究结果,为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索。

三种抗-HCV检测试剂盒对无偿献血者筛检价值评价

目的 :评价 3种抗 HCV筛检试剂对无偿献血者的筛检价值 .方法 :以卫生部临床检验中心抗 HCV临床科研血清盘标本 5 0份为评价标本 ,分别用快速试剂法 ,国产ELISA试剂及进口ELISA试剂对评价标本作盲法检测 ,以卫生部临床检验中心血清盘标本所提供的阴性和阳性结果为金标准 ,用四格表法计算出评价真实性及可靠性指标 ,并对ELISA法的cut off值的合理性进行评价 .结果 :快速试剂法 ,国产英科新创ELISA试剂盒与进口傲拓ELISA试剂盒的灵敏度分别为4 8% ,88% ,76 % ,特异度均为 1 0 0 % ,准确度分别为 74 % ,94 % ,88% .约登指数分别为 0 .4 8,0 .88,0 .76 .3种试剂盒的重复符合率均为 1 0 0 % .国产英科新创ELISA试剂盒规定的cut off值是合理的 ,而进口傲拓ELISA试剂盒规定的cut off值太高 .结论 :3种试剂盒的灵敏度与准确度以国产ELISA试剂盒为最好 ,3种试剂盒的重复性均好 ,因此使用 2种优选的国产ELISA试剂盒对血液进行联合筛检 ,既可以保证输血的安全性 。

RNAi对HCV ns5b基因表达的抑制作用

目的 :研究RNAi(RNAinterference)效应对HCVns5b基因表达的抑制作用 .方法 :根据HCVns5b基因序列及其二级结构特征 ,依据Tuschl等设计siRNA的原则 ,确定并合成了针对ns5b基因的siRNAs;利用电转化方法将合成的siRNAs转染NS5B EGFPHepG2细胞株 ,以未转染的细胞为对照 ;细胞爬片后经DAPI染色 ,荧光显微镜下观察和半定量RT PCR法检测siRNAs的抑制效应 .结果 :化学合成的siRNAs可以抑制HCVns5b基因的表达 ,效率可达 70 %-80 %以上 .结论 :在细胞水平上 ,化学合成的siRNAs可以抑制HCVns5b基因的表达 。