长QT综合征相关钙调蛋白突变体E141G的C末端片段载体构建和蛋白制备

目的构建长QT综合征(LQTS)相关钙调蛋白(CaM)突变体E141G的C末端片段(C-lobe_(E141G))原核表达载体并进行蛋白表达、纯化及活性鉴定。方法将C-lobe_(E141G) cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads对融合蛋白进行分离纯化,经蛋白酶切除GST标签后,分别采用SDS-PAGE及BCA方法检测纯化后的目的蛋白纯度及浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果GST-C-lobe_(E141G)融合蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度C-lobe_(E141G)蛋白。纯化后C-lobe_(E141G)蛋白具有能与CaV1.2型钙通道结合并维持大鼠心室肌细胞通道开放的活性。结论成功构建可以表达生物活性蛋白的C-lobe_(E141G)原核表达载体,可为CaM的C-lobe位点突变介导的LQTS机制研究提供材料基础。

血清集聚蛋白C末端片段水平在老年心力衰竭并发肾损伤患者中的临床意义

目的检测老年心力衰竭(简称心衰)患者血清集聚蛋白C末端片段(C-terminalagrin-fragment,CAF)水平,分析其与心衰并发肾损伤的相关性。方法收集2013年12月至2014年12月在皖南医学院弋矶山医院住院的NYHA分级3~4级的老年心衰患者180例;根据是否eGFR<60mL/(min·1.73m^2),将入选的心衰患者分为肾损伤组和非肾损伤组。比较两组间临床特征、实验室检查指标及血清CAF水平。结果心衰患者中有71例患者并发肾损伤,肾损伤组血清CAF水平显著高于非肾损伤组(ng/L:975±369vs.712±350,P=0.028)。相关性分析显示,心衰并发肾损伤与CAF水平密切相关(r=0.249,P=0.001),在校正年龄、性别、血肌酐、胱抑素C等因素后,CAF升高仍是肾损伤的危险因素之一(OR=1.102,95%CI1.008~1.118,P<0.045)。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示,CAF>760.7ng/L判断肾损伤的AUC为0.690,预测敏感度0.842,特异度为0.423。结论部分心衰患者并发肾损伤,其血清CAF水平升高,并与肾功能密切相关,异常升高的血清CAF对判断心衰并发肾损伤有重要的临床意义。

钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备

目的构建钙调蛋白(Ca M)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,Clobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法将上述c DNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav1.2型钙通道结合并可恢复已"rundown"心肌细胞膜钙通道的活性。结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究Ca M的生物学功能奠定了基础。

Cav1.2钙通道C末端远端片段dDCT重组质粒的构建及蛋白制备

目的构建Cav1.2钙通道C末端远端片段(dDCT)(2 080~2 169)质粒,表达、提取、纯化蛋白并进行生物学活性鉴定。方法将dDCT的cDNA片段插入pGEX-6p-1质粒载体并转化大肠杆菌,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导蛋白表达,超声破碎法提取蛋白。GS-4B beads纯化蛋白后,pull-down方法分析其生物学活性。结果构建的dDCT质粒经限制性内切酶和测序双重鉴定成功,经超声破碎法提取的dDCT蛋白纯度和浓度均较高,并具有能够与GST-CT1融合蛋白浓度依赖性结合的生物学活性。结论本研究成功构建了dDCT重组质粒,为深入探讨Cav1.2钙通道的自身调节机制奠定了重要的物质基础。

HER2与前列腺癌

HER2蛋白由位于17q21的HER2基因编码,是人类表皮生长因子受体的成员之一。HER2基因在前列腺癌中很少有扩增。HER2蛋白在约40%前列腺癌中呈高表达,尤其是在经抗雄激素治疗者及雄激素非依赖性者。针对HER2的单克隆抗体对前列腺癌的治疗效果不明显,HER2蛋白的C末端片段的存在及其作用可以解释这一现象。

β-分泌酶抑制剂对tau过磷酸化大鼠β-CTF代谢的影响及机制研究

目的:在tau过磷酸化大鼠中,通过检测淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)C末端片段的表达,研究抑制β-分泌酶(BACE1)对其代谢的影响及机制。方法:24只SD大鼠随机分为四组,包括正常对照组、假手术组、OA组、OA+BACE1抑制剂组。Western blot法检测β-CTF、APP及BACE1表达;RT-PCR法检测APP及BACE1;水迷宫检测大鼠行为学。结果:OA组β-CTF表达显著增加(p<0.05),而OA+BACE1抑制剂组与OA组相比,β-CTF表达减少(p<0.05);四组大鼠的APP在蛋白及mRNA水平表达无显著差别(p>0.05);OA组BACE1在蛋白及mRNA水平的表达增加,而OA+BACE1抑制剂组BACE1的蛋白表达较OA组减少(p<0.05),两组大鼠mRNA表达水平无明显差异(p>0.05)。OA+BACE1抑制剂组大鼠在给予BACE1抑制剂后行为学有所改善(p<0.05)。结论:(1)tau过磷酸化通过促进神经元内BACE1表达,导致APP代谢途径发生转变,从而引起β-CTF表达增加;(2)β-CTF表达增加可引起tau过磷酸化大鼠行为学改变;(3)抑制BACE1可改善大鼠的学习及记忆能力,支持BACE1作为AD的治疗靶点。

β分泌酶抑制剂对冈田酸诱导PC12细胞淀粉样蛋白前体蛋白代谢的影响

目的探索β分泌酶抑制剂对冈田酸（OA）诱导的PC12细胞淀粉样蛋白前体蛋白（APP）代谢的影响。方法10nmol／L OA作用4h、8h、16h、24h及48h诱导PC12细胞tau磷酸化，加β分泌酶抑制剂干预，MTT法测定细胞抑制率，免疫细胞化学法及Western blot检测全长APP和β-C末端片段（βCTF）。结果10nmol／L OA对PC12细胞的抑制作用呈时间依赖性，β分泌酶抑制剂可明显减轻该作用。OA诱导PC12细胞内全长APP和βCTF含量增加，β分泌酶抑制剂进一步增加细胞内全长APP含量，并减少βCTF含量。结论OA诱导PC12细胞中APP主要经β分泌酶途径代谢，生成具有神经毒性的βCTF。β分泌酶抑制剂通过维持细胞存活和减少βCTF从而减轻OA诱导的神经毒性，但使细胞内APP进一步增多。