猪瘟病毒C株表位突变毒株的构建及拯救

本研究旨在突变猪瘟病毒C株WH303位点,构建感染性克隆,为猪瘟病毒C株标记疫苗的研究提供候选毒株。本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经重叠PCR方法突变WH303位点,再分别连接至C株和C-flag株全长感染性克隆。体外转录RNA,转染PK15细胞,细胞连续传代完成病毒的拯救和增殖。结果显示,经特异性限制内切酶酶切反应验证,感染性克隆构建成功。经RT-PCR、过氧化物酶单层细胞试验检测,表明病毒成功拯救。病毒细胞传代至17代,检测到病毒,表明病毒可以稳定传代。综上,本研究成功构建了C株WH303突变感染性克隆MC和MC-flag,并成功拯救MC株,得到可以稳定传代的病毒株。

C株猪伪狂犬病疫苗免疫效果评价

越来越多的文献证实,国内流行的猪伪狂犬病毒株已经发生变异,其毒力、致病特点已经有了明显不同,因此很多人开始质疑经典毒株对新流行毒株的保护力。目前,国内很多疫苗厂家已经将猪伪狂犬病疫苗毒株更换为新的变异毒株,将其缺失致弱后用作疫苗株,比较知名的如HB-2000株、C株等。猪伪狂犬病病毒C株的不同之处在于其是自然致弱的毒株,病毒培养效果更好,容易收获更高的毒价,但其确切的效果还需要逐步验证。

猪伪狂犬疫苗C株在伪狂犬野毒阳性场的免疫策略与净化思路

伪狂犬野毒株gE阳性猪场,在商品猪育肥过程中经常出现呼吸道疾病反复高发现象,不仅造成育肥期投药成本高,且在继发感染严重时极易出现高死亡率,对规模猪场造成严重经济损失。在本案例中该猪场为伪狂犬野毒株gE阳性,一直免疫传统Barth-K61毒株疫苗,但在120日龄以上商品猪育肥期经常出现呼吸道系统疾病,经检测分析判定为伪狂犬病与传染性胸膜肺炎混合感染,投药效果不理想。2021年11月在育肥区选用美保龙生物伪狂犬C株疫苗与传统Barth-K61毒株作平行对比发现,美保龙伪狂犬C株组157日龄育肥猪有1头gE抗体阳性、1头可疑;传统Barth-K61毒株组141日龄、152日龄育肥猪gE抗体全为阳性。说明美保龙伪狂犬C株疫苗保护时间长,保护期可至育肥后期。该养殖场于2022年开始全面使用美保龙伪狂犬C株疫苗,西育肥区2023年第1季度检测结果显示120日龄以上育肥猪gE抗体均为阴性,东育肥区推迟了免疫时间导致120日龄以上育肥猪gE抗体均为阳性,此案例证明临床伪狂犬防控不仅需要优质的疫苗还需要科学合理的免疫程序,也为该场下一步对伪狂犬全面净化打下坚实基础。

猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救

【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50.mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)不能检测出病毒。【结论】成功构建了猪瘟病毒C株感染性克隆;拯救C株时以SK6细胞电转较好;带毒细胞传代培养C株有利于获得较高滴度的病毒。

猪瘟病毒C株杂交瘤细胞的构建及单克隆抗体的制备与鉴定

采用猪瘟病毒C株毒（CSFV C strain）免疫BALB/C小鼠，按照常规单克隆抗体制作方法构建并筛选出能稳定分泌抗猪瘟单克隆抗体杂交瘤细胞株4株，分别命名为1C9，1B11，3C8和3G9，经鉴定，4株单克隆抗体腹水效价达到104~106。交叉试验及特异性试验表明，所制备的McAb与鸽新城疫病毒、猪蓝耳病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、鸡减蛋综合征病毒无交叉反应性，均完全针对猪瘟病毒（CSFV）抗原决定簇，具有高度特异性。抗CSFV McAb的成功制备，为进一步研究建立CSFV的快速诊断方法奠定了基础。

猪瘟病毒C株特异的TCR Vα5和Vβ6真核表达载体的构建及共转染研究

本实验室前期研究发现猪瘟病毒C株特异的TCR Vα5和TCR Vβ6基因家族,为进一步研究其体外表达情况,应用RT-PCR从猪外周血单个核细胞中扩增其全长基因序列,并构建TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP重组质粒,将其转染293T细胞。结果显示,TCR Vα5和TCR Vβ6全长基因分别为816bp和945bp,双酶切和核酸序列测定证实TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP重组质粒构建正确;转染293T细胞24h后荧光显微镜下可以看到70%以上的细胞表达EGFP蛋白。此外,实时荧光定量PCR可检测到TCR Vα5和TCR Vβ6基因的表达,单独转染组和共同转染组Western blot均可检测到EGFP蛋白的表达,且蛋白杂交带强度相似。研究结果表明,CSFV-C株特异性的TCR Vα5-pIRES2-EGFP和TCR Vβ6-pIRES2-EGFP真核表达质粒可同时转染到293T细胞中,实现体外共表达。

伪狂犬病C株与Bartha-K61株活疫苗在gE抗体阴性场的免疫效果比较

某伪狂犬病野毒阴性场,分别选用伪狂犬病疫苗C株和Bartha-K61株做仔猪免疫平行对比试验,采用IDEXX伪狂犬病ELISA试剂盒检测抗体滴度和阳性率,评估母源抗体干扰度和维持时间。检测结果表明,某厂家C株伪狂犬病疫苗效果优于某厂家Bartha-K61毒株。研究为规模猪场伪狂犬病疫苗毒株的选择提供参考依据。

嵌合猪瘟病毒基因Ⅱ型E2抗原区的重组C株病毒构建及其生物学特性

【目的】目前使用的基因Ⅰ型猪瘟兔化弱毒C株疫苗是公认的安全、有效疫苗,但近年来基因Ⅱ群的猪瘟流行毒株比例增高,因此对猪瘟(CSF)的有效防控提出了更高要求。本研究旨在通过反向遗传学技术构建适应CSFV基因Ⅱ型的新型C株疫苗,为标记疫苗的开发奠定基础。【方法】在构建的C株感染性克隆基础上,拯救嵌合CSFV基因Ⅱ型HZ1-08毒株E2抗原区的重组C株病毒RecCHZE2,并分析其致病性和免疫原性。【结果】重组嵌合病毒RecCHZE2接种家兔后出现典型的定型热,兔脾脏肿大;重组嵌合病毒RecCHZE2接种猪只后没有发热和明显的白细胞减少,在接种后第12天检测到一过性的病毒血症;对接种猪血清检测结果表明,针对2型毒株的相应抗体在接种后的20 d达到高峰;接种猪血清针对C株和HZ1-08毒株的中和抗体效价相当,但C株免疫猪血清对流行毒株的中和抗体水平降低。【结论】重组嵌合病毒RecCHZE2不仅保留C株病毒弱毒的特性,且可提高针对Ⅱ型流行毒株的抗体水平。

猪瘟病毒C株兔脾毒在SK6细胞中的增殖培养及其鉴定

Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), direct florescent antibody staining, and RT-PCT were used to detect growth characteristics of Cassical swine fever virus C-strain (Derived from Spleen) in SK6 cell. The results indicated than C-strain (Derived from Spleen) can grow in SK6 cell at a lower level. Direct florescent antibody staining method was not suitable for the detection of attenuated lapinized C-strain. The study provided a primary guide for the detection of attenuated classical swine fever virus. It also supplies an elementary foundation for the study of its growth characteristic in SK6.

猪瘟病毒弱毒C株ST细胞传代疫苗对仔猪的免疫效果

将猪瘟病毒弱毒C株ST细胞苗以不同剂量(106 TCID50和105 TCID50)免疫28日龄仔猪,通过临床症状观察、病理剖检和组织病理学观察、抗体检测、特异性淋巴细胞增殖试验及抗原检测等方法评价疫苗免疫效果。结果表明:该疫苗接种仔猪后无任何临床症状,无病毒血症,无排毒现象;不同剂量免疫组,在2免后10 d左右猪瘟特异性抗体阳转,抗体水平于2免后20 d左右达到峰值。以上结果表明,猪瘟弱毒疫苗毒株C株的ST细胞传代疫苗对仔猪安全有效。

猪瘟病毒C株截短E2基因在大肠杆菌中表达及免疫原性初步检测

本试验利用PCR技术,扩增得到猪瘟病毒(CSFV)C株E2基因的主要抗原片段A/D区549bp,将其酶切纯化后,与已酶切纯化的pET-32a进行16℃过夜连接,转化大肠杆菌BL21。从转化成功的氨苄培养板挑取合适菌落进行PCR,挑取目的条带正确的菌落加至LB培养基进行过夜培养后送测序。将测序正确的菌液划板,挑菌培养并用IPTG进行诱导表达。得到的蛋白进行SDS-PAGE,在约39ku位置有蛋白条带。将蛋白纯化后,分别利用自制兔抗CSFV阳性血清及临床检测阳性的猪抗CSFV阳性血清进行Western blotting检测,可见在39ku处有单一条带,表明表达的蛋白具有免疫原性。本试验结果为下一步ELSIA试剂盒的组装奠定基础,方便对猪场免疫猪群猪瘟抗体水平进行监控。

猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)——10年回眸

1猪瘟及C株疫苗概况猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的高度传染性疾病,给许多国家的养猪业造成了重大的经济损失[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列入须申报(Notifiable)的动物疫病名录。在国务院印发的《国家中长期动物疫病防治规划(2012~2020年)》中,将猪瘟列为5种优先防治的“一类动物疫病”之一。

猪瘟C株疫苗诱导PBMCs中SLA等位基因差异性表达分析

猪主要组织相容性复合体(SLA)广泛参与机体免疫应答与调节,具有重要的免疫学研究意义。在转录水平上对猪瘟C株疫苗免疫后猪外周血单个核细胞(PBMCs)中SLA的表达情况进行了初步研究。猪瘟C株疫苗免疫试验猪后,在0、3、5、9d分别采集4头猪的抗凝血分离外周血单个核细胞,通过逆转录荧光定量PCR技术(RT-qPCR)对外周血单个核细胞中的SLA进行转录水平的相对定量检测;并对试验猪SLA上调表达明显的cDNA模板进行了SLAⅡ类分子的克隆、测序及其系统发育树分析。结果显示,猪瘟C株疫苗免疫后,PBMCs中SLAⅠ、SLAⅡ类分子在短时间内均出现上调表达,一段时间后发生回降;测序分析发现,上调表达的SLA-DRA、SLA-DRB分子中存在高频表达序列。结果提示,猪瘟C株疫苗能够刺激机体产生猪瘟病毒相关的免疫应答,并存在SLA等位基因优势选用现象,这种优势选用可为猪瘟表位肽疫苗的研制提供理论依据。

猪瘟病毒C株检测用国家核酸标准物质的研制

为研制均匀、稳定的猪瘟病毒(CSFV)核酸标准物质,选择CSFV C株接种于PK-15细胞并收获病毒液,然后经过病毒灭活、分装、冻干,最终形成核酸标准物质。用微滴式数字PCR对制备的CSFV标准物质进行均匀性和稳定性评估、标准物质合作定值,在评定不确定度后计算得出最终量值结果,并开展临床试用。结果显示,该标准物质均匀,4℃条件下可稳定存放4周,25℃可稳定存放1周,-20℃可稳定存放11个月,量值结果为(5.1±0.7)×10^5 copies/mg;临床试用显示,所制备的标准物质与临床样本的互通性良好。本研究制备的CSFV C株国家核酸标准物质均一性良好、稳定、量值准确度高,并通过了全国标准物质管理委员会评定,可用于动物及动物产品质量安全检测,从而有效保障猪瘟防治工作的开展。

表达增强型绿色荧光蛋白的报告猪瘟病毒C株的构建及在家兔中生物学特性评价

猪瘟兔化弱毒疫苗C株是我国自主研发的,用于预防猪瘟(CSF)的最好弱毒活疫苗。然而,现阶段的C株不具备标记功能,无法区分野毒感染与疫苗接种。本研究旨在将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因插入猪瘟病毒(CSFV)C株将其构建为报告病毒,为C株的基础研究提供病毒示踪工具,同时提供构建标记C株疫苗的方法。本研究中,笔者在CSFV C株中引入EGFP基因,分别构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告CSFV rHCLV-EGFP,以及用CSFV强毒Shimen(SM)株Npro基因替换C株Npro基因后再引入EGFP基因的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP。通过猪瘟抗原ELISA检测,直接观察荧光及Western blot检测EGFP的蛋白表达等方法对拯救的病毒进行鉴定,并在细胞和家兔上评价这两株病毒的生物学特性。结果显示,两株报告病毒的抗原ELISA结果均为阳性;在感染rHCLV-EGFP的细胞中并未观察到绿色荧光也未检测到EGFP蛋白,但在感染rHCLV-Npro(SM)-EGFP的细胞中观察到EGFP的绿色荧光并检测到EGFP蛋白;细胞试验结果表明,两株报告病毒与亲本病毒具有相似的生长特性且遗传稳定;家兔试验发现,rHCLV-Npro(SM)-EGFP保留了C株的在家兔体内的生物学特性,但rHCLV-EGFP失去了C株诱导家兔定型热反应的能力。构建的嵌合报告病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP可以作为C株的报告病毒进行应用:可以对病毒示踪,用于研究C株的复制过程、病毒与细胞的相互作用;同时,该嵌合报告病毒也具备发展为标记C株疫苗的潜力。

伪狂犬活疫苗C株抗体消长规律及攻毒保护试验

应用中和试验法对伪狂犬活疫苗C株免疫仔猪进行抗体水平动态监测,结果表明,疫苗接种7 d产生中和抗体,42 d抗体水平达到高峰,180 d时抗体仍保持较高水平。攻毒试验证实,免疫后80%免疫仔猪获得保护。确定伪狂犬活疫苗C株免疫保护期可持续6个月。

猪伪狂犬病毒C株的分离鉴定

在流行病学调查中分离到的1株伪狂犬病毒,命名为猪伪狂犬病毒C株,并对其进行鉴定、纯化。在gE和gI基因段上设计特异性引物进行PCR检测,闽A株在5 000 bp处出现目的条带,该毒株在1 500 bp附近出现目的条带,对目的条带测序,扩增产物大小为1 538 bp,在第989—4 468位基因缺失,缺失片段大小为3 570 bp,该缺失片段包含了伪狂犬病病毒的主要毒力基因(gE基因),除此缺失片段外,分别在第873、4 665、4 666、4 950位发生了碱基突变,同猪伪狂犬病病毒Bartha K61同源性为95.0%—96.0%,与PRV Bartha K61不是同一个毒株。用该毒株对部分省市分离到的伪狂犬毒株和标准毒株闽A株进行中和试验,中和指数为708—6 761,该毒株可完全中和临床分离的伪狂犬病毒株,故可用作候选疫苗毒株。

猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)免疫效果研究

为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)在规模猪场的临床使用效果,选取300头14日龄仔猪,平均分为2组,免疫组于14日龄每头肌肉注射圆环病毒2型灭活苗2 mL,对照组每头注射生理盐水2 mL,于免疫前后不同时间点采集7次血样检测各阶段圆环病毒2型抗体,并记录2组在保育及肥育阶段的生长指标。结果显示,免疫后第7天,免疫组抗体阳性率明显升高,免疫后第14天免疫组抗体阳性率已达97%。与对照组相比,免疫组猪在保育阶段日增重提高16 g、料重比降低0.08、成活率提高5.4个百分点;在肥育阶段,日增重提高32 g、料重比降低0.07、呼吸道病发病率下降16.5个百分点、成活率提高3.7个百分点。结果表明,试验猪免疫猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)可预防圆环病毒对猪体的危害,提高猪群整体健康度及成活率、饲料转化率和平均日增重。

猪瘟C株克隆油乳剂浓缩弱毒疫苗的免疫力和保存期试验

猪瘟是猪的一种急性、烈性、接触性传染病，对养猪业危害极大，国际兽疫局将其列为Ａ类１６种传染病之一，定为国际检疫对象。７０年代以来，国外先后报道分离到猪瘟低毒力毒株，国内许多地方也散发慢性非典型性猪瘟，近年来随着猪及其产品的大量流通，猪瘟流行有回升的趋...

猪圆环病毒2型ZJ/C株增殖条件的优化

为了在PK15细胞上获得更高滴度的猪圆环病毒2型(PCV2)ZJ/C株,本实验优化了细胞接种密度、接毒方法、接毒量与收获时间和冻融次数等条件。结果表明接种密度在2.5×10~5个/m L,同步接毒加D-氨基葡萄糖处理,接毒量为2%,接毒后90h收获,-20℃冻融2次,PCV2-ZJ/C株增殖效果最好。该结果为猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)的生产提供了依据。