破伤风毒素C片段单克隆抗体的研制

目的:研制抗破伤风毒素C片段(TetC)的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化蛋白His-TetC免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆。Westernblot鉴定mAb的特异性,并用mAb亚类试剂盒鉴定mAb亚类。结果:共获得5株稳定分泌抗TetC的杂交瘤细胞株,分别命名为1E5、5G10、6B9、7D6、7F5,其腹水效价除1E5为3×210外,其余均为1×105,亚类鉴定结果均为IgG1。West-ernblot分析结果显示,5株mAb均与融合蛋白His-TetC发生特异性反应。结论:成功制备了抗TetC的mAb,为进一步研究TetC的生物学功能、破伤风毒素结构与功能的关系以及建立快速检测破伤风抗毒素水平的方法奠定了基础。

破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达

目的构建破伤风毒素C片段(TETC)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法将采用基因拼接方法获得的TETC基因从测序正确的质粒pBS-TETC上以SalⅠ、HindⅢ切下,分别定向连接到以XhoⅠ、HindⅢ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBC1000和膜锚定表达的乳链菌表达载体pNBC2000。电穿孔转化乳链菌,分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白,通过蛋白电泳及Western blot检测蛋白定位表达情况。结果构建了分泌表达及锚定表达TETC的乳链菌表达载体pNBCL1002与pNBCL2002,电穿孔转化乳链菌获得了分泌表达及膜锚定表达TETC的乳链菌,SDS-PAGE分析显示分泌表达的TETC大小约为57.8 kD,表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%,锚定表达的TETC大小约为73.5 kD的表达蛋白,表达量占总体蛋白的10.7%、膜蛋白的17.9%;Western blot检测显示所表达的TETC均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。结论成功构建了TETC乳链菌表达载体并在乳链菌内表达TETC,初步验证了表达的TETC的免疫反应性,这一结果可能为进一步研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定基础。

体外拼接破伤风毒素C片段基因

目的以破伤风毒素C片段(TETC)基因为例,探讨区段基因拼接方法。方法根据已知的TETC基因序列(GenBank登记号M12739,367-1719),结合乳链菌氨基酸密码子的基因编码情况,设计适于在乳链菌内表达的TETC基因序列,为进一步克隆,根据同义突变的原理消除序列中的EcoRI和KpnI的酶切位点,在TETC基因的5′端加上SalI酶切位点,3′端加上XhoI和HindⅢ酶切位点,序列全长1383bp。将其中1380bp的片段使用DNAstar6.0设计为68条长40bp的寡核苷酸TETC_1-TETC_68,设计TETC_69作为下游引物。分3个区段分别拼接TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,随后分别以TETC_1、TETC_69为上下游引物,进行TETC全长基因的拼接,将获得的TETC基因经SalI和HindⅢ双酶切后连接到经相同双酶切的p BluescriptⅡSK(+),得到的阳性克隆经测序鉴定。结果分别拼接出大小约500bp的TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,等浓度的3个区段混合后,拼接出了全长为1383bpTETC基因,目的基因连接到载体后测序与设计的TETC基因完全一致。结论区段基因拼接法采用分段拼接的方法先拼接出全长基因的组成部分,随后进行全长基因拼接,更适合长基因片段的体外拼接。

B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。

破伤风毒素C片段(TTc)在大肠杆菌中的表达、优化与鉴定

HTSS以一株破伤风生产菌株基因组DNA为模板,通过上游引物中几个碱基的修改,PCR扩增出破伤风毒素C片段(TTc)基因,构建了原核表达质粒pET-42(b)/TTc,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。重组蛋白分子量约50kD,表达量为22%,超声波破碎显示为可溶性重组蛋白。通过对培养基、诱导时间、诱导温度的优化,重组蛋白的表达量和可溶性均有提高。Western blotting检测表达产物可与破伤风C片段单克隆抗体产生特异的免疫反应。该工作为亚单位疫苗或载体蛋白的开发奠定了基础。

破伤风毒素C片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出1356bp的破伤风毒素C片段基因,该片段是与靶细胞起结合作用的重链C端基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登陆的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆入大肠杆菌融合表达载体pET-30a(+),构建成重组表达质粒pET-TetC,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达,经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物约为50000的重组蛋白,其表达量占菌体总蛋白的33.5%,经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。动物试验证明,此重组抗原具有良好的免疫原性,能保护动物免受破伤风毒素的攻击。

破伤风毒素C片段基因克隆、重组表达及免疫原性研究

应用PCR技术从破伤风梭状芽孢杆菌DNA中扩增出1．4kbDNA基因，将其克隆到pUC18质粒中，经测序证明该DNA片段为破伤风片段C的基因，并将此基因片段亚克隆到pGEX-4T-2,构建成表达质粒pGEX－TC在E．coli中进行表达。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹鉴定，表达产物为76KD的特异性重组蛋白。动物实验显示：1μg重组蛋白免疫动物，可使动物产生1IU／ml的破伤风抗毒素单位，动物血清的抗体滴度可达1：800。

破伤风毒素C片段的基因克隆、重组表达及免疫原性

应用PCR技术直接从破伤风芽孢杆菌质粒DNA中扩增出 1 4Kd的破伤风毒素C片段基因 ,经DNA序列测定证明其为破伤风片段C基因。将此基因克隆入大肠杆菌谷胱甘肽 S 巯基转移酶融合表达载体pGEX 4T 2 ,构建成重组表达质粒pGEX TC。经SDS PAGE蛋白电泳鉴定 ,表达产物为 76Kd的特异性重组蛋白。免疫印迹实验证实 ,重组蛋白抗原是破伤风C片段抗原。动物实验证明此重组抗原具有良好的免疫原性 ,1μg免疫剂量可使动物产生 1～ 2IU/ml的破伤风抗毒素 ,ELISA抗体滴度可达 1∶80 0。

破伤风毒素C片段神经特异性载体的研究进展

目前,针对许多中枢神经系统疾病的传统疗法的效果不甚令人满意,这些难治性疾病包括帕金森病等神经退行性疾病、颅脑损伤、脑卒中后遗症及中枢神经系统恶性肿瘤等.

血清集聚蛋白C末端片段水平在老年心力衰竭并发肾损伤患者中的临床意义

目的检测老年心力衰竭(简称心衰)患者血清集聚蛋白C末端片段(C-terminalagrin-fragment,CAF)水平,分析其与心衰并发肾损伤的相关性。方法收集2013年12月至2014年12月在皖南医学院弋矶山医院住院的NYHA分级3~4级的老年心衰患者180例;根据是否eGFR<60mL/(min·1.73m^2),将入选的心衰患者分为肾损伤组和非肾损伤组。比较两组间临床特征、实验室检查指标及血清CAF水平。结果心衰患者中有71例患者并发肾损伤,肾损伤组血清CAF水平显著高于非肾损伤组(ng/L:975±369vs.712±350,P=0.028)。相关性分析显示,心衰并发肾损伤与CAF水平密切相关(r=0.249,P=0.001),在校正年龄、性别、血肌酐、胱抑素C等因素后,CAF升高仍是肾损伤的危险因素之一(OR=1.102,95%CI1.008~1.118,P<0.045)。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示,CAF>760.7ng/L判断肾损伤的AUC为0.690,预测敏感度0.842,特异度为0.423。结论部分心衰患者并发肾损伤,其血清CAF水平升高,并与肾功能密切相关,异常升高的血清CAF对判断心衰并发肾损伤有重要的临床意义。

PPF1基因C端片段在大肠杆菌中的融合表达和纯化以及抗体制备

PPF1是与G2豌豆短日不衰老现象紧密相关的基因之一 .以pSK PPF1为模板 ,用PCR方法得到了编码该蛋白C端的基因片段 ,称为PPFC .进一步将该基因片段克隆到中间载体pGEM T easy ,再酶切得到PPFC片段插入到pGEX 4T 1载体中 ,构建成表达质粒pGEX 4T PPFC .在BL2 1细胞中经IPTG诱导表达 ,得到GST PPFC融合蛋白 .用GST亲和柱纯化得到PPFC蛋白 ,将其作为抗原得到兔源的多克隆抗体 .Western杂交分析表明所得到的抗体具有较强的特异性 ,ELISA分析证实其效价为 10 6.该抗体的获得为用免疫沉淀等免疫分析技术研究PPF1与其它蛋白质的相互作用 。

基质金属蛋白酶-2C端片段pex的克隆、测序及真核表达载体的构建

目的 :克隆小鼠基质金属蛋白酶 - 2 ( MMP- 2 ) C端片断 pex编码区的 c DNA序列 ,并构建其真核表达载体 ,为进一步研究其抑制肿瘤作用奠定基础。方法 :根据基因 Gen Bank中 MMP- 2基因的碱基序列 ,利用 RT- PCR的方法从 NIH3T3细胞中分别扩增信号肽及目的基因 pex,然后用多重 PCR的方法将两个片段拼接起来 ,再将拼接起来的目的片段 sig- pex与 p MD1 8T载体连接作全自动测序 ,利用亚克隆的方法将 sig- pex c DNA片段克隆到 pc DNA3.1载体中。结果 :DNA测序证实该片断序列与文献报道完全一致。结论 :成功构建出 pc DNA3.1 - sig-

人MASP1和MASP2 C端片段的原核表达

目的在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)相关丝氨酸蛋白酶1、2(MASP1、MASP2)C端片段。方法采用PCR技术从分别含人MASP1、MASP2cDNA的质粒pGEM-MASP1、pGEM-MASP2中扩增MASP1、MASP2C端基因片段,将其插入原核表达载体pET17b,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达MASP1、MASP2C端蛋白,通过Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA进行鉴定。结果分别从pGEM-MASP1和pGEM-MASP2中扩增到约1300bp的基因片段,构建成重组表达载体,经酶切出现约3300bp和1300bp片段,测序结果与预期的完全一致。纯化蛋白经SDS-PAGE可见Mr40000蛋白带,该蛋白可与抗His抗体反应。结论获得了重组人MASP1和MASP2C端片段蛋白及其表达菌株,为MASP分子的进一步研究提供了条件。

小鼠canstatin C端片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了构建小鼠canstatin C端片段的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。以小鼠肝脏组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠canstatin C端片段(mCan-C)基因,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将mCan-C基因定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET/ mCan-C,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。结果表明,小鼠canstatin C端片段的cDNA 长度为399bp,含有1个终止密码,编码132个氨基酸,与已知的人canstatin C端片段氨基酸的同源性为61%。IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E.coli BL21中表达,表达量约占菌体总蛋白量的28%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。首次克隆了小鼠canstatin C端片段的cDNA,IPTG诱导mCan-C在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达。小鼠canstatin C端片段的cDNA序列已收入GenBank,接受号为:AY502947。

心肌营养素1／破伤风毒素重链C端片段融合蛋白的构建及其靶向大鼠嗜铬细胞瘤细胞的研究

目的:探讨心肌营养素1(cardiotrophin 1,CT1)/破伤风毒素重链C端片段(tentanus toxin Cfragment,TTC)(CT1/TTC)融合蛋白的构建及其对大鼠嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma,PC12)细胞的靶向性。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)、T-A克隆等分子生物学方法构建CT1/TTC融合蛋白。体外培养PC12细胞,并将CT1/TTC融合蛋白与PC12细胞共培养,红色荧光免疫组化染色后在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白能否在TTC的靶向作用下进入PC12细胞。结果:成功构建了CT1/TTC融合蛋白,测序显示融合基因序列正确,免疫组化染色结果显示融合蛋白能够进入PC12细胞,并发出红色荧光。结论:采用PCR和T-A克隆等分子生物学方法能成功构建CT1/TTC融合蛋白,并且TTC能够将CT1靶向进入PC12细胞。

重组破伤风毒素C片段的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化重组破伤风毒素C片段(rTTC),并进行活性鉴定。方法采用PCR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTC-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTC蛋白经离子交换、凝胶层析两步纯化后,采用Western blot、免疫双扩散及动物免疫试验进行活性及免疫原性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体和可溶性形式存在;纯化的重组蛋白纯度大于95%,能与全段破伤风毒素(TT)抗体反应,rTTC抗体能与全段TT反应。rTTC能较好地诱导家兔产生免疫反应,但诱导小鼠产生的免疫反应较弱。结论已原核表达并纯化了rTTC,其有望开发为一种新型抗破伤风芽孢梭菌疫苗及细菌多糖类结合疫苗的蛋白载体。

钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备

目的构建钙调蛋白(Ca M)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,Clobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定。方法将上述c DNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化。采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性。结果蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav1.2型钙通道结合并可恢复已"rundown"心肌细胞膜钙通道的活性。结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究Ca M的生物学功能奠定了基础。

人补体片段C5a蛋白的可溶性表达、纯化及生物学活性检测

目的:为得到可溶性表达的人补体片段C5a蛋白,并检测其生物学活性。方法:用IPTG对C5a融合蛋白进行诱导表达,表达产物经肠激酶酶切后用Ni2+分离柱纯化得到C5a蛋白,通过对中性粒细胞的趋化作用、呼吸爆发、产生乳铁蛋白等实验检测C5a蛋白的生物学活性。结果:成功获得可溶性表达的C5a融合蛋白,通过肠激酶酶切后得到高纯度的C5a蛋白,C5a蛋白对人中性粒细胞具有明显的趋化作用,能引起人中性粒细胞的呼吸爆发并能诱导人中性粒细胞产生乳铁蛋白。结论:可溶性表达了具有生物学活性的人补体片段C5a蛋白,为进一步的临床研究和应用奠定了基础。