大肠杆菌素C结构域之外部分也存在与膜结合的区域

Colicins(大肠杆菌素蛋白)是一类由大肠杆菌分泌的毒素蛋白,它们能在其敏感菌株内膜上形成电压门控的离子通道,造成膜内离子外流,导致细胞死亡。

特应性皮炎患者血清C型凝集素结构域家族4成员G水平及其意义

目的探究特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)患者血清C型凝集素结构域家族4成员G(C-type lectin domain family 4 member G,CLEC4G)水平及其临床价值。方法收集60例AD患者(观察组)和29例对照者(对照组)血液样本,检测样本中CLEC4G、白细胞介素-33(interleukin-33,IL-33)、总免疫球蛋白E(total IgE,tIgE)、特异性免疫球蛋白E(specific IgE,sIgE)及嗜酸性粒细胞水平;分析CLEC4G水平与AD患者临床资料及IL-33间的相关性;采用logistic回归分析CLEC4G、IL-33等指标评估AD发病的风险。结果与对照组相比,观察组患者血清CLEC4G水平显著降低[(359.4±57.3)pg/mL vs(521.8±48.1)pg/mL];CLEC4G水平在儿童期、青少年与成年期及男、女性AD患者中均差异无统计学意义(P>0.05);与tIgE≤100 kU/L组相比,CLEC4G水平在100~200 kU/L组、tIgE≥200 kU/L组患者中显著降低,但在100~200 kU/L组、tIgE≥200 kU/L组间无显著差异;血清CLEC4G水平只在AD病情中度组中显著降低,在其他组间差异无统计学意义(P>0.05);IL-33在观察组患者血清中水平升高,但CLEC4G与IL-33间无显著相关性(r=0.090,P=0.495);年龄小于14岁、IL-33是AD发病的危险因子,OR值分别为2.756、1.241,95%CI分别为1.076~7.060、1.030~1.495;而CLEC4G为AD发病的保护因子(OR=0.890,95%CI:0.809~0.979)。结论CLEC4G可能是独立于IL-33介导AD发病的保护因子。

含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶和调控细胞G1／S期转换的基因之间的关系在癌症发病机制中的作用

含有JumonjiC结构域的组蛋白去甲基化酶（JHDM）可调控多种基因的转录，影响细胞周期进程，参与癌症发生。本文就JHDM和调控细胞由DNA合成前期向DNA合成期转换的基因的关系作一综述。

高低级别胶质瘤中包含Jumonji C结构域蛋白6表达的差异及其与预后的关系

目的:探讨包含Jumonji C结构域蛋白6(JMJD6)在高低级别胶质瘤中表达的差异及其与胶质瘤预后的关系。方法:从2018年1月至2020年12月广东省人民医院神经外科收治的胶质瘤患者中随机抽取42例肿瘤标本,分为低级别组和高级别组,其中,低级别18例、高级别24例;用免疫组织化学法检测两组JMJD6的表达并采用t检验和χ^(2)检验比较两组JMJD6表达水平的差异;随访患者术后肿瘤复发及患者死亡,按JMJD6表达水平(去除阴性病例),分为低JMJD6表达组和高JMJD6表达组,随访40个月,采用χ^(2)检验、Kaplan-Meier曲线和Pearson相关分析JMJD6表达水平与预后的关系。结果:低级别组JMJD6的表达呈阴性7例、低表达9例、高表达2例;高级别组阴性0例、低表达9例、高表达15例;低级别胶质瘤JMJD6表达水平(2.06±2.88)与高级别胶质瘤JMJD6表达水平(7.88±1.90)比较,差异有统计学意义(t=-7.449,P<0.01)。低JMJD6表达组18例,高JMJD6表达组17例;低JMJD6表达组复发7例,复发率38.89%,死亡病6例,死亡率33.33%;高JMJD6表达组复发14例,复发率82.35%,死亡13例,死亡率76.47%;两组复发率及死亡率比较,差异均有统计学意义(χ^(2)=6.882,P<0.01和χ^(2)=6.556,P<0.05);JMJD6的表达水平与复发率及死亡率呈正相关(r=0.626、0.659,P<0.001);与低JMJD6表达组比较,高JMJD6表达组的患者生存时间更短(χ^(2)=7.631,P<0.01)。结论:胶质瘤级别越高,JMJD6表达水平也越高,JMJD6表达水平越高,肿瘤越易复发,患者预后越差,JMJD6有助于预测肿瘤复发及预后。

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-typelectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Westernblot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1357bp,包括125bp的5′末端非翻译区(UTR)、1026bp的开放阅读框(ORF)和206bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12~48h时MnLec3表达量显著升高,48h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。

多波长反常散射法解析Sau3AI蛋白C端结构域晶体结构

用同步辐射装置收集了Sau3AI的C端蛋白晶体在Se吸收边附近三个波长下的衍射数据,通过多波长反常散射(Multi-wavelength Anomalous Dispersion,MAD)法解决了晶体的衍射相位问题,解析了Sau3AI的C端蛋白的结构。结果表明,Sau3AI-C的结构与DNA错配修复蛋白MutH相似,结构中间的凹槽是Sau3AI-C与DNA的潜在结合区域。

中国恒河猴DNGR-1分子C型凝集素样结构域在大肠杆菌系统表达

目的获得恒河猴C型凝集素结构域家族9的A成员(Clec9A)基因编码区序列;体外表达CLEC9A的C型凝集素样结构域(CTLD)。方法利用Clec9A基因特异引物,反转录PCR扩增中国恒河猴Clec9A基因编码区,亚克隆至pGEM-T载体,获得pGEM-T-DNGR质粒并进行测序。构建CLEC9A分子的CTLD区原核表达质粒pET-32a-CTLD,转化BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,并用SDS-PAGE和Western blot法对目的蛋白进行鉴定。结果 PCR扩增得到726 bp的Clec9A编码区全长,测序和序列比对发现恒河猴CLEC9A编码区的核苷酸序列与人和小鼠的同源性分别为95.0%和73.1%,推测的氨基酸同源性分别为91.7%和57.3%。体外表达获得相对分子质量(Mr)约32 000的CTLD融合蛋白,Western blot方法鉴定发现其与人DNGR-1分子具有相似的抗原性。结论中国恒河猴Clec9A基因与人的高度相似并能编码与人CTLD抗原性相似的蛋白。

N端非催化结构域对微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响

为了明确非催化结构域碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)和F5/8 C型结构域对褐藻胶裂解酶AlgL7酶学性质的影响,构建并表征了全长酶AlgL7和两个截短酶CD1(催化结构域)和CD2(包含F5/8 C型结构域和催化结构域)。结果表明,与全长AlgL7相比,截短酶CD2表现出更高的比活力、热稳定性和K_(m)值,以及更高的最大反应速率(V_(max)值),表明CBM结构域在保持酶与底物的亲和力方面具有重要作用,但降低了酶的催化活性、热稳定性和V_(max)值。与截短酶CD1相比,CD2表现出更高的比活力、最适反应温度、热稳定性、最大反应速率和Km值,表明F5/8 C型结构域有利于提高酶的催化活性、最适反应温度、热稳定性和最大反应速率,但降低了酶与底物的亲和力。以海藻酸钠为底物,截短酶CD2的比活力为183.9 U/mg,最适反应温度和最适反应pH值分别为40℃和7.0,K_(m)值和V_(max)值分别为39.80 mg/mL和2000 U/mg,酶解产物主要为褐藻胶寡糖二糖和三糖。本研究促进了非催化结构域与褐藻胶裂解酶性质的构效关系研究,为利用非催化结构域改善褐藻胶裂解酶的催化性质提供了一定理论基础。

凝血因子Ⅷ C2结构域表达载体的构建及其在真核细胞NIH3T3中的表达

目的 :构建人凝血因子 F 中具有免疫活性的 C2结构域表达载体并通过真核宿主细胞表达出多肽。方法 :从 HEK2 93细胞提取总 RNA,经 RT- PCR扩增获得目的片段。将该片段与信号肽共同构建在同一表达载体 ,并在 NIH 3T3细胞中表达 ,Western blotting检测。结果 :经限制性酶切鉴定和测序分析证实 ,采用 RT- PCR成功地完成 F - C2 c DNA的扩增和表达载体的构建 ,重组载体转染进入 NIH 3T3细胞后 ,经检测培养上清中的蛋白成分证实 ,成功地表达出 F - C2结构域多肽。结论 :重组表达载体的构建是表达出分泌型 F C2多肽的一种可行的方法。

C型凝集素结构域家族1成员B在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的 探讨C型凝集素结构域家族1成员B(CLEC1B)在肝细胞癌(HCC)组织中的表达及其与HCC患者临床病理特征和预后的关系。方法 利用基因表达汇编(GEO)数据库检索HCC组织芯片数据(GSE49515、GSE115018)对癌组织及正常对照样本中的基因进行差异表达分析。在肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库筛选HCC转录组数据集,分析CLEC1B在HCC中的差异表达。采用基因集富集分析(GSEA)探寻HCC中与CLEC1B相关的信号通路。收集37例HCC患者的癌组织和相应的癌旁组织,采用实时荧光定量PCR法检测CLEC1B mRNA表达,蛋白质印迹分析法检测CLEC1B蛋白表达,并采用χ^2检验分析CLEC1B表达与患者临床病理特征的关系,通过Kaplan-Meier法和log-rank检验分析CLEC1B mRNA表达与HCC患者预后的关系;留取37例HCC患者和37名健康志愿者血液标本,用酶联免疫吸附试验检测血浆中CLEC1B水平,通过受试者工作特征(ROC)曲线评估CLEC1B对HCC的诊断价值。结果 CLEC1B在HCC癌组织中低表达,CLEC1B的低表达与HCC患者的肿瘤出血有关(P<0.01)。血浆中CLEC1B水平可作为诊断HCC的生物标志物,以62.44 ng/mL作为截断值时,CLEC1B的诊断效能最佳(ROC曲线下面积为0.966,灵敏度为92.7%,特异度为91.3%)。高表达CLEC1B的HCC患者总生存期长于低表达CLEC1B的患者,差异有统计学意义(P<0.01)。在HCC中,CLEC1B基因与ATR通路(ATM and Rad3-related pathway)、细胞周期通路、DNA修复通路、myc信号通路呈现出一致的表达差异趋势。结论 CLEC1B在HCC中低表达并与肿瘤出血有关,CLEC1B低表达的患者预后较差。

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA(命名为HbC2)。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5'-UTR和232bp的3'-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。

精氨酸激酶C端结构域的克隆及其表达纯化

精氨酸激酶（Arginine kinase,AK）由一个小的球形N端结构域和一个大的C端结构域构成。将来源于基围虾的AK C端结构域基因成功克隆到了原核表达载体pET-28a上,然后再转入Rosetta进行表达。探讨了AK C端结构域的最佳表达条件,当OD600达到0.5~0.7时,用终浓度为0.2 mmol.L-1的异丙基硫代--βD-半乳糖苷（IPTG）在20℃下诱导培养5~6 h,AK C端结构域在上清中大量表达。采用His-Tag金属螯合亲和层析纯化、不连续梯度咪唑洗脱,得到了电泳纯的AK C端结构域。

人源Pelota C端结构域的纯化、结晶及晶体结构分析

Pelota在进化上是非常保守的RNA结合蛋白,人源Pelota mRNA分布于几乎所有的组织并作为一个多功能的蛋白参与多种生物途径.为解析人源Pelota C端结构域(C-terminal domain,CTD)的晶体结构,首先在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达,并采用亲和层析、凝胶过滤柱层析的方法,获得了纯度大于97%的蛋白.动态光散射实验表明纯化的蛋白有较高的均一性.在筛选了1 852个结晶条件后,优化的人源Pelota CTD蛋白晶体能衍射X射线至0.26nm分辨率.蛋白晶体的空间群为P6522,晶胞常数a=7.882nm,b=7.882nm,c=19.746nm.上述结果为进一步研究Pelota的功能及其与下游蛋白的相互作用奠定了结构基础.

第一类肽链释放因子C端结构域参与调控终止密码子的识别过程

真核生物蛋白质翻译终止过程中,第一类肽链释放因子(eukaryotic polypeptide release factor,eRF1)利用其N端结构域识别终止密码子。eRF1的N结构域中的GTS、NIKS和Yx Cxxx F模体对于终止密码子的识别发挥重要作用。但至目前为止,eRF1识别终止密码子的机制,尤其是对于终止密码子的选择性识别机制仍不清楚。我们构建了四膜虫(Tetrahymena thermophilia)eRF1的N端结构域与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)eRF1的M和C结构域组成的杂合eRF1,即Tt/Sc eRF1和Tt/Sp eRF1。双荧光素酶检测结果证实,两种杂合eRF1在细胞中识别终止密码子的活性具有显著差异。Tt/Sc eRF1仅识别UGA密码子,与四膜虫eRF1一致,具有密码子识别特异性;而Tt/Sp eRF1可以识别3个终止密码子,无密码子识别特异性。为解释这一现象,将Sp eRF1的C结构域中的1个关键的小结构域中的氨基酸进行突变,与Sc eRF1相应位点的氨基酸一致。分析结果显示,突变体Tt/Sp eRF1识别密码子UAA和UAG的性质发生显著变化,说明第一类肽链释放因子的C端结构域参与了终止密码子的识别过程。这提示,四膜虫eRF1识别终止密码子的特异性可能依赖于eRF1分子内的结构域间相互作用。本研究结果为揭示肽链释放因子识别终止密码子的分子机制提供了数据支持。

噬菌体phi29末端酶gp16蛋白C端结构域在溶液中的构象分析

噬菌体phi29是一种双链DNA病毒,它的增殖和成熟过程需要将较大的子代DNA包装入一个空间极其有限的新生病毒衣壳中,这一步骤由其转运马达完成.转运马达具有三个部分:头颈连接器蛋白(the connector)、pRNA和ATP水解酶蛋白(gp16).在结构预测中发现gp16蛋白的C端结构域可能与pRNA或DNA结合,但尚未有相关文献可以证明这种相互作用,因此其结构的解析成为研究其功能的关键.本文利用大肠杆菌SUMO表达系统,对噬菌体phi29 gp16蛋白的C端结构域进行重组构建并诱导表达后,通过Ni-NTA亲和层析纯化,再用分子排阻色谱获得高纯度的目的蛋白质单体,纯度达到95%左右.最后用X射线小角散射技术(small angle X-ray scattering)对其构象进行分析,收集小角散射数据,当目的蛋白的浓度为1.3 g/L、所得到的目的蛋白的三维结构与同源蛋白FtsK的晶体结构高度拟合,且通过CRYSOL软件反推计算的曲线与实验曲线高度重合.通过原核表达、纯化及结构分析,成功获得了该结构域在溶液中的状态信息.这一研究不仅为后续关于该结构域的功能研究奠定基础,也为病毒感染的诊断和治疗提供新思路.

His-tag的人胞浆磷脂酶A_2的C2结构域的表达、纯化及性质

带有His tag的人胞浆磷脂酶A2 的C2结构域高效表达 ,用内源荧光的变化测定了其稳定性和其与钙离子结合的结合常数 .结果表明 ,带有His tag的C2结构域仍可有效用于研究其折叠及其与钙离子的协同性结合 ,温度从 2 2℃升高到 35℃时 ,C2结构域和钙离子结合的协同性程度显著增强 .

水稻OsGAP1 C2结构域中对钙离子的结合能力强于对钾离子

钙离子作为植物细胞的第二信使,广泛参与植物应对不同逆境胁迫的信号调控过程。水稻G蛋白促进蛋白1(Oryza sativa GTPase-activating protein 1,OsGAP1)包含1个C2结构域,而含C2结构域的蛋白质是一类钙离子结合蛋白质,受钙信号的调控。本研究鉴定了水稻OsGAP1的由5个保守性天冬氨酸残基组成的阳离子结合区域。该区域可结合2个钙离子或者钾离子,且其结合钙离子的强度高于其结合钾离子的强度,但是不能结合镁离子。当将其中2个保守的天冬氨酸残基(Asp-23和Asp-28)突变为丙氨酸后,其对钙离子的结合能力减弱。对OsGAP1 C2结构域阳离子结合区域结合金属离子能力的研究,有助于加深对钙信号调控蛋白质的认识,为其在农业生产中的应用提供理论依据。

CLEC1B、DKK1、DRD4在原发性肝癌病变组织中的表达及临床意义探究

目的分析C型凝集素结构域家族1成员B(C-type lectin domain family 1 member B,CLEC1B)、分泌型蛋白Dickkopf 1(DKK1)、多巴胺受体D4(dopamine receptor D4,DRD4)在原发性肝癌(primary hepatic cancer,PHC)患者病变组织中的表达及临床意义。方法回顾性选取2022年1月~2023年1月在四川大学华西医院接受肝癌切除术且经术后病理证实为PHC的138例患者,取其癌组织与癌旁组织石蜡病理标本,分析其CLEC1B、DKK1、DRD4表达情况及和临床病理特征关联性,Pearson法分析CLEC1B、DKK1、DRD4的相关性。结果肝癌组织中CLEC1B、DRD4表达水平均低于癌旁肝组织,肝癌组织中的DKK1蛋白表达较癌旁肝组织更高(P<0.05),且3者均主要分布于细胞浆;CLEC1B低表达、DKK1高表达、DRD4低表达分别97例(70.29%)、91例(65.94%)、78例(56.52%),PHC患者的CLEC1B低表达与术前AFP水平、血管侵犯、远处转移、肿瘤出血等密切相关(P<0.05),DKK1高表达与术前AFP水平、BCLC Kinki分期、肿瘤数目、肿瘤大小密切相关(P<0.05),DRD4低表达与术前AFP水平、肿瘤数目、肿瘤大小、卫星结节、血管侵犯密切相关(P<0.05);Pearson相关分析显示,PHC患者CLEC1B、DRD4与DKK1表达水平呈负相关(r=-0.809、r=-0.774,P<0.001),CLEC1B与DRD4表达水平呈正相关(r=0.748,P<0.001)。结论CLEC1B、DRD4在PHC患者癌变组织中呈低表达,而DKK1呈高表达,且与临床病理参数有关,CLEC1B、DKK1、DRD4可能参与PHC发生发展,有一定检测意义。

Toll作用蛋白C2结构域的纯化和结构研究

在大肠杆菌中高表达了谷胱甘肽S转移酶(GST)-Toll作用蛋白C2结构域融合蛋白,并通过GST磁珠纯化融合蛋白,用凝血酶把GST和C2结构域切开,采用尺寸排阻色谱纯化了C2结构域.用圆二色谱和核磁共振波谱法研究了C2结构域在三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液中的结构,结果表明C2结构域在缓冲液中形成了以β折叠为主的结构.

C1q蛋白家族的结构、分布、分类和功能

C1q蛋白家族由众多含C1q结构域的蛋白组成,从细菌到高等哺乳动物中都有分布。这类蛋白由一条信号肽、胶原样区(Collage-like region,CLR)和C1q球状结构域(Globular C1q domain,gC1q)组成。C1q蛋白家族根据其结构特点,可分为三大类分子:C1q、C1q-like和ghC1q。C1q是补体经典途径的起始分子,能够识别免疫复合物,启动补体系统经典途径;此外,作为一种模式识别受体分子(Pattern recognition receptor,PRR),它可以结合种类繁多的配体。C1q-like蛋白的结构类似于C1q分子,含有CLR和gC1q结构域,在水蛭中参与神经系统的修复,在脊椎动物中实现从凝集素到免疫球蛋白结合分子的功能转变,参与补体系统的激活。ghC1q蛋白只具有gC1q结构域和一段短的N末端序列,包括分泌型蛋白(sghC1q)和非分泌型蛋白(cghC1q)。sghC1q在无脊椎动物固有免疫系统中发挥重要作用;脊椎动物中的sghC1q可作为一类新型跨神经元调节因子,在大脑的许多区域调节突触发育和突触可塑性。cghC1q基因最早可追溯至芽孢杆菌属的细菌中,具有典型的gC1q果冻卷结构,说明gC1q结构域有着非常悠久的进化历程且结构高度保守。文章对C1q蛋白家族的结构、分布、分类以及功能进行综述,以期为从事该领域研究的科研人员提供有益参考。