马链球菌兽疫亚种重组表面蛋白rSeseC-02147免疫效力评价

【目的】通过原核表达系统制备马链球菌兽疫亚种(SEZ)重组表面蛋白rSeseC-02147,并系统评价其抵御SEZ感染的免疫效力,为SEZ亚单位疫苗的研发提供候选抗原。【方法】构建原核表达载体pCold I-SeseC-02147,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,纯化回收重组蛋白rSeseC-02147并免疫BALB/c小鼠,以SEZ灭活疫苗为阳性对照、PBS为阴性对照,二免后第14 d于小鼠颌下静脉采集血清,分别采用Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组蛋白rSeseC-02147反应原性及小鼠血清抗体效价和抗体亚型属性;并通过小鼠免疫保护试验、腹腔灌洗液细菌载量测定及脏器组织病理学观察,系统评估重组蛋白rSeseC-02147对小鼠的免疫保护力。【结果】构建的原核表达载体pCold I-SeseC-02147经IPTG诱导能成功表达获得重组蛋白rSeseC-02147,其纯化后的浓度为2.86 mg/mL。重组蛋白rSeseC-02147能与免疫组和阳性对照组小鼠血清发生特异性反应,而与阴性对照组小鼠血清未发生特异性反应,表明重组蛋白rSeseC-02147具有良好的反应原性与特异性;以重组蛋白rSeseC-02147免疫小鼠产生的血清抗体效价远高于SEZ灭活疫苗,且IgG1亚型极显著高于IgG2a亚型(P<0.01,下同)。重组蛋白rSeseC-02147可为小鼠提供抵御SEZ感染的免疫保护力,攻毒后14 d内的存活率60%;此外,重组蛋白rSeseC-02147免疫小鼠后的腹腔灌洗液细菌载量极显著低于阴性对照组小鼠,且肺脏、肾脏和脾脏等组织的病理损伤程度较轻。【结论】通过原核表达系统制备获得的重组蛋白rSeseC-02147具有良好的特异性与反应原性,通过抑制SEZ增殖及减轻SEZ对机体脏器的损伤而发挥免疫保护作用。可见,重组蛋白rSeseC-02147具有开发成SEZ亚单位疫苗的潜力。

豚鼠源马链球菌兽疫亚种的分离鉴定

为了查明河北省唐山市某豚鼠养殖场发病豚鼠感染的病原菌,本试验采集发病豚鼠的眼角脓性分泌物,采用细菌分离纯化、革兰染色、生化鉴定、16S rRNA基因PCR扩增方法对分离菌进行鉴定,通过K-B试纸法检测分离菌株对24种抗菌药的敏感性,试管二倍稀释法测定19种中药对该分离菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),并通过动物回归试验检测该分离菌株的致病性。结果显示,分离菌株在血琼脂培养基培养24 h生长为针尖状透明菌落、呈β溶血,革兰染色为阳性圆球状、3~5个连接呈短链状,生化特性与马链球菌兽疫亚种相符,将其命名为MLQJ-1;16S rRNA序列比对结果显示,MLQJ-1与马链球菌兽疫亚种同源性高达99.72%,在系统进化树中处于同一分支,鉴定为马链球菌兽疫亚种;MLQJ-1对24种抗菌药的敏感性不同,对青霉素、头孢曲松和阿莫西林等8种抗菌药敏感,对阿米卡星、新霉素和卡那霉素等10种抗菌药耐药;苦地丁、苦参、黄芩和千里光对MLQJ-1的MIC值介于1.9~15.6 mg/mL,MBC值介于1.9~31.2 mg/mL;小鼠腹腔接种MLQJ-1菌液后24 h内全部死亡。结果表明,马链球菌兽疫亚种为本次发病豚鼠的病原菌,青霉素、头孢曲松和苦地丁等药物对该菌具有较强的抑菌效果。

马链球菌兽疫亚种表面蛋白FIPP的免疫效力评价

【目的】评价马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus,SEZ)表面蛋白FIPP(纤维蛋白原和Ig结合蛋白前体)的免疫效力,为预防SEZ感染提供新的候选疫苗抗原。【方法】根据NCBI数据库公布的FIPP基因序列设计引物进行PCR扩增,将扩增片段克隆到原核表达载体pColdⅠ,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,FIPP蛋白通过IPTG诱导在大肠杆菌中表达及纯化,以SDS-PAGE进行鉴定。纯化后的重组蛋白FIPP(rFIPP)对BALB/c小鼠进行免疫,二免14 d后对小鼠进行免疫保护试验并采集血清;解剖感染SEZ小鼠的肝脏、脾脏和肺脏进行病理组织学观察。以酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测小鼠血清中的特异性抗体IgG水平,以蛋白质印迹(Western blotting)方法检测重组蛋白的反应原性,通过全血杀菌试验检测血清的杀菌活性。【结果】通过SDS-PAGE电泳可观察到约96 k D的蛋白片段,与FIPP蛋白的理论分子量相符。重组蛋白rFIPP免疫小鼠后对SEZ攻击的保护率达70.0%。ELISA方法检测结果表明,重组蛋白rFIPP免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体免疫球蛋白G(IgG),且极显著高于阴性对照(P<0.01,下同),通过IgG亚型分析,发现IgG1的抗体水平显著高于IgG2a(P<0.05),说明重组蛋白rFIPP免疫后产生的抗体亚型以IgG1为主。全血杀菌试验结果表明,重组蛋白rFIPP超免血清对SEZ具有极显著杀灭作用。组织病理学观察结果显示,重组蛋白rFIPP免疫后能有效减弱小鼠各类器官的病理损伤。【结论】经表达纯化的重组蛋白rFIPP在小鼠感染SEZ模型中具有良好的免疫保护效力,可用作制备SEZ亚单位疫苗的有效候选抗原。

马链球菌兽疫亚种SclE蛋白原核表达;及其免疫效力评价

【目的】探究马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ)表面蛋白SclE的免疫效力,为预防SEZ引起的链球菌病提供理论依据。【方法】采用PCR扩增SEZ的SclE基因,再将该片段克隆至原核表达pCold I载体上,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后以SDS-PAGE进行分析鉴定,获得的重组蛋白SclE(rSclE)(100μg/mL,0.5 mL)以腹腔注射形式免疫BALB/c小鼠(n=10,一免、二免的周期均为14 d)。一免、二免14 d后收集血清,通过ELISA和Western blotting检测抗体水平和特异性。二免后进行免疫保护试验,并对攻毒后小鼠的肝、脾、肺、肾进行细菌载量检测和病理组织学观察。【结果】SDS-PAGE检测到大小约为93 kD的蛋白表达,与SclE的理论分子量大小一致;Western blotting检测显示,表达所得重组蛋白能与SEZ阳性对照组(腹腔注射0.5 mL SEZ灭活疫苗)小鼠血清发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。ELISA检测显示,二免后小鼠血清中特异性抗体水平与一免后相比均有显著提升(P<0.05,下同),且可诱导小鼠产生高滴度的IgG,其中IgG1抗体水平(0.436±0.031)显著高于IgG2a(0.161±0.009),表明rSclE诱导的抗体亚型以IgG1为主;rSclE免疫小鼠可显著抑制SEZ在各脏器中的增殖能力,肝脏、脾脏出血及炎性细胞浸润的症状得到改善,肺脏和肾脏出血等病理损伤减轻;在小鼠免疫攻毒保护试验中保护70%小鼠免受致死剂量SEZ毒株的攻击。【结论】成功表达获得的rSclE能诱导小鼠产生SclE特异性抗体,且具有较好的保护效果,可作为一种SEZ潜在的疫苗候选抗原。

支气管败血波氏菌共培养对马链球菌兽疫亚种致病相关特性的影响

旨在探究犬的传染性呼吸道疾病常见病原支气管败血波氏菌(Brodetella bronchiseptica,Bb)与马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidimicus,SEZ)共培养对2种细菌各自致病生物学特性的影响。将相同浓度菌体的SEZ与Bb在PBS中共培养24 h,然后采用平板划线法分离共培养后的单菌落SEZ(SEZBb)和Bb(BbSEZ),比较共培养前后菌株的生物被膜形成能力、对上皮细胞的黏附能力、抗巨噬细胞吞噬能力、胞内存活能力以及感染小鼠的存活率和组织细菌载量等方面的差异。结果显示:共培养后,BbSEZ的细菌数量和致病生物学特性均无明显改变,但SEZBb较单独培养的SEZ在细菌数量上减少约67%,在生物被膜形成能力、对上皮细胞A549的黏附能力以及在巨噬细胞内的存活能力等方面均有显著提升,对小鼠的致病性增强,且大大提高了对脑组织的侵袭能力。研究结果为揭示多病原混合感染的致病机制奠定了基础。

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类M蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1μL(20pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。

马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白的提取

马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp.zooepidemicus) 是引起我国猪链球菌病的主要病原之一 ,其类M蛋白是一重要的毒力因子和保护性抗原。用热酸提取的马链球菌兽疫亚种ATCC352 4 6株类M蛋白 ,作SDS PAGE电泳 ,在电泳图谱中出现相对分子质量为 43 0 0 0、 34 0 0 0、33 0 0 0、31 0 0 0和 30 0 0 0等 5条主蛋白带。免疫印迹显示 ,这 5条主蛋白带都能被ATCC352 4 6的全菌兔血清识别 。

羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验小鼠免疫攻毒法研究

为解决羊败血性链球菌病灭活疫苗现行规程中效力检验采用靶动物免疫攻毒法所存在的动物筛选困难、动物质量不稳定、经济花费高等问题,开展了实验动物免疫攻毒替代方法研究。以靶动物免疫攻毒法为基础,确定该疫苗的最小保护剂量和不保护临界剂量,并在确认小鼠品系后开展平行关系研究,从而筛选出在小鼠模型上能够体现疫苗差异的最佳攻毒剂量。结果显示:合格疫苗1/2稀释度为最小免疫剂量,1/4稀释度为不符合规定的临界剂量;KM小鼠为替代方法最合适的小鼠品系;最佳攻毒剂量为使用2 MLD混合菌液,对免疫组和对照组进行攻毒,对照小鼠全部死亡,免疫小鼠至少保护70%。本研究建立了羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验实验动物免疫攻毒替代方法,这将有助于提升该类疫苗效力检验的稳定性和可靠性,为羊败血性链球菌病防控提供有力支撑。

马链球菌兽疫亚种类M蛋白的基因克隆、序列分析及其在猪源链球菌的检测

根据已发表的马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp .zooepidemicus)马源株的类M蛋白基因序列 ,设计和合成一对引物 ,以兽疫亚种猪源ATCC35 2 4 6株的基因组DNA为模板 ,通过PCR技术 ,扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET_32a(+)中 ,测定其序列 ,GenBank接收号为AY2 6 3781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框 ,全长为 1137bp ,编码 379个氨基酸残基。经DNAStar软件分析 ,ATCC35 2 4 6株类M蛋白基因与兽疫亚种马源W6 0株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为 86 9%、30 8%、2 9 4 % ;推导的氨基酸序列的同源性分别为 84 3%、2 1 9%、2 3 4 %。但ATCC35 2 4 6株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验 ,检测 34株猪源链球菌类M蛋白基因 ,发现所有 16株C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因 ,而所有猪链球菌 (Streptococcussuis) 1型和 2型菌株及S群、B群、D群链球菌共 13株均不能检出类M蛋白基因 ,而 5株未鉴定的猪源链球菌中 3株能检测出类M基因。

马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验

将含猪链球菌 2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,表达了相对分子质量为 6 0 0 0 0左右的融合蛋白。利用组氨酸亲和层析柱 ,获得了纯化的融合蛋白 ,质量浓度为 4 2 μg·mL-1。以纯化的融合蛋白、宿主菌BL 2 1经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清、马链球菌兽疫亚种ATCC 35 2 4 6株和猪链球菌 2型HA 980 1株制备的二联灭活苗为免疫原 ,分别免疫 30头仔猪。初次免疫 1月后 ,以同样的剂量再次免疫 ,3周后以 5×LD50 的ATCC 35 2 4 6和HA 980 1强毒株进行攻击。结果 ,纯化融合蛋白免疫组的免疫保护率达 6 0 % ,BL 2 1上清免疫组的免疫保护率为 5 0 % ,全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达 90 %。

猪链球菌2型与马链球菌兽疫亚种生物学特性的初步比较

1998年从病死猪分离了数株链球菌 ,其中 2株编号为 980 1,980 2。经鉴定 ,980 1株为猪链球菌 2型 ,980 2株为马链球菌兽疫亚种。 980 1株系从暴发流行地区的病猪中分离 ,同时在该流行地区还发生畜禽从业人员感染相同血清型的链球菌而死亡的病例 ;980 2株系从散发病猪中分离。临床有共同点 ,又有各自特点。病理变化均呈现典型的败血症变化 ,但肝、脾、肺等病变上有一些差别 ,而染色镜检基本一致。对兔均敏感 ,对小白鼠和猪的敏感性有所不同。 980 1株菌落灰色 ,中心浑浊 ,直径 0 5mm ,α溶血 ,有草绿色色素沉着 ;980 2株菌落湿润 ,半透明 ,直径 1 5～ 2mm ,β溶血。 980 1株对氧哌嗪青霉素、头孢他啶、氨苄青霉素最敏感 ;980 2株对氧哌嗪青霉素、复方磺胺、头孢哌酮。

马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗小鼠免疫试验

为获得控制猪链球菌病安全高效的疫苗,本试验进行了马链球菌兽疫亚种类M蛋白亚单位疫苗的研制。应用热酸法提取马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白,并分别采用羟基磷灰石(HAT)层析和冷酒精沉淀法进行纯化,结果得到较纯的类M蛋白。用热酸提取的粗制类M蛋白、2种纯化的类M蛋白及全菌苗免疫小鼠,结果保护率分别为92%(11/12)、100%(12/12)、100%(12/12)和83%(10/12),表明类M蛋白亚单位疫苗有进一步开发的必要。

马源马链球菌兽疫亚种新疆株的分离鉴定及遗传特性分析

为了解马源马链球菌兽疫亚种(S.zooepidemicus)新疆分离株马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzM)基因的分子进化与变异情况,为该菌引起的感染性疾病的防控提供依据,本试验对新疆地区某马场采集的病马淋巴结样品进行病原菌的分离培养和生化鉴定,并对分离菌株进行药物敏感性试验。根据已发表的马源SzM基因序列设计引物,对其SzM基因进行PCR扩增及序列测定。将获得的SzM序列与GenBank中不同动物源马链球菌兽疫亚种分离株序列进行同源性比对和遗传进化分析。结果显示,分离得到了一株革兰氏阳性链球菌,将其命名为马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1。药物敏感性试验结果表明,分离菌株对青霉素、磺胺嘧啶钠耐药,对其他14种药物均敏感。序列分析结果显示,马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与国内外不同动物源分离株SzM基因氨基酸同源性为56.0%～70.0%。遗传进化分析结果显示,这些菌株可分为4个群。马链球菌兽疫亚种ZMSY15-1与猪源分离株SzM蛋白的氨基酸同源性为59.9%,分别属于2个不同的群,其与美国马源分离株NH55426亲缘关系最近。本试验结果可丰富国内马源马链球菌兽疫亚种SzM基因的信息数据,为马链球菌兽疫亚种的致病机制研究和预防控制提供参考依据。

猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

目的阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性,为疫苗研制提供指导。方法利用PCR技术,扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因,并进行克隆、测序及序列分析。结果发现7株类M基因长度为1137bp,含一个阅读框,CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1143bp及1125bp。除1株关节炎分离株CP-0104外,引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%,推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源;除CP-0104外,其余8株高变区高度同源。结论国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。

马链球菌兽疫亚种10株国内猪源分离株对小鼠免疫效力的评价

目的近年来马链球菌兽疫亚种引起的猪链球菌病在我国造成重大损失。为评价猪源兽疫亚种分离株的抗原变异,取国内10省市分离的10株猪源兽疫亚种分离株,分别制备灭活抗原,加入弗氏完全佐剂免疫12 w龄ICR小鼠,4 w后加入弗氏不完全佐剂进行再次免疫,再次免疫2 w后分别用5 LD50同源菌株和1.6×105CFU ATCC35246株攻击。结果表明,同源菌株攻击,免疫保护率均在90%以上;而以ATCC35246攻击的异源菌免疫小鼠,免疫保护率为80%-100%。可见我国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有应用前景。

猪源马链球菌兽疫亚种灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价

【目的】评价中国不同地区猪源马链球菌兽疫亚种分离株抗原性的差异,为猪链球菌病疫苗的研制提供指导。【方法】取从国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种分离株,分别制备灭活疫苗,免疫12周龄ICR小鼠,用同源菌株和ATCC35246株攻击。【结果】以同源菌株攻击免疫小鼠,除CG-74-63株外,其余菌株的保护率均在90%以上;而以异源菌株ATCC35246进行攻击,免疫小鼠的免疫保护率为80%～100%。【结论】中国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有保护性。

猪源马链球菌兽疫亚种类 M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。

猪链球菌2型与马链球菌兽疫亚种生物学特性的初步比较

１９９８年从病死猪分离了数株链球菌（其中２株编号为９８０１，９８０２），经鉴定，９８０１株为猪链球菌２型，９８０２株为马链球菌兽疫亚种。９８０１株系从暴发流行地区的病猪中分离，同时在该流行地区还发生畜禽从业人员感染相同血清型的链球菌而死亡的病例；９８０２株系从散发病猪中分离。临床有共同点，又有各自特点。病理变化均呈现典型的败血症变化，但肝、脾、肺等病变上有一些差别，而染色镜检基本一致。对兔均敏感，对小鼠和猪的敏感性有所不同。９８０１株菌落灰色，中心浑浊，直径０．５ｍｍ，α溶血，有草绿色色素沉着；９８０２株菌落湿润，半透明，直径１．５－２ｍｍ，β溶血。９８０１株对氧哌嗪青霉素、头孢他啶、氨苄青霉素最敏感；９８０２株对氧哌嗪青霉素、复方磺胺、头孢哌酮、呋喃妥因最敏感。

马链球菌兽疫亚种中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的克隆与表达

目的 构建马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp zooepidemicus)中国株的类M蛋白基因抗原表位片段的重组表达质粒 (pET -Szp) ,并检测表达产物的免疫反应性。 方法 根据GenBank登录的马链球菌兽疫亚种纽约分离株w6 0类M蛋白基因序列设计和合成引物 ,以该菌中国分离株ATCC35 2 4 6的基因组DNA为模板 ,扩增类M蛋白基因 5’端第 5 83～ 10 6 8bp片段 ,并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pET - 32a(+)中 ,将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1株 ,用IPTG诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和免疫印迹对表达蛋白进行初步分析。结果 扩增出 4 86bp的马链球菌兽疫亚种ATCC35 2 4 6的类M蛋白基因片段 ,该基因在大肠杆菌表达系统中经诱导 ,得到分子量为 5 0 0 0 0的表达产物 ,免疫印迹表明该产物具有特异的免疫反应性。结论 成功构建了表达马链球菌兽疫亚种中国株类M蛋白片段的重组表达质粒 ,并实现在大肠杆菌中表达 ,为重组类M蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。