番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因的克隆和序列分析

根据已发表的番鸭呼肠孤病毒(DRV)δC蛋白基因的核苷酸序列设计引物,应用RT-PCR技术,扩增番鸭呼肠孤病毒δC蛋白基因,经T/A克隆,插入到pMD18-T载体上,测序分析结果表明MW9710株δC蛋白基因的开放阅读框为810nt,编码由269个氨基酸组成,分子量为29.4Ku的δC蛋白。应用BLAST等分子生物学软件分析,其与法国DRV89330株的δC蛋白基因的同源率达93%,所推导的氨基酸的同源率达93%,与ARV的核苷酸无同源性,推倒的氨基酸的最大同源率为26%。经Antheprot5.0蛋白质软件分析表明:MW9710株δC蛋白具有较大的疏水性和抗原性,无跨膜区,为进一步研究该基因的表达和研制基因工程疫苗及诊断试剂奠定基础。

番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因在毕赤酵母中表达

将番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC蛋白基因与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9Kσ-C,转化大肠杆菌DH5α,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9Kσ-C用内切酶SacⅠ线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合,采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了高效表达,并且具有免疫反应性。

乙型肝炎病毒C蛋白基因的克隆表达

根据已知的C蛋白基因序列设计一对引物,用PCR法从HBVadw亚型全基因组克隆中扩增出约500bp的DNA片段。将该基因克隆到表达质粒pQE30中,转化大肠杆菌,进一步对重组质粒中的插入片段进行DNA测序,证明是C基因。阳性克隆子经IPTG诱导后,获得了目的蛋白的表达,菌体经超声破碎后,目的蛋白主要存在于上清中,为下一步研究其抗原性和免疫原性奠定了基础。

HCV C蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其抗原表位分析

HCV是单股正链RNA病毒,不同分离株之间其基因组序列变异较大,不同区段变异程度也各不相同,相比之下C区(核衣壳蛋白)比较保守,推测可能具有重要的生物学功能。 利用各种不同的表达系统对HCV C蛋白的研究结果表明,初步加工产物为191个氨基酸,进一步的研究表明成熟的HCV C蛋白约为120个氨基酸。我们在基因克隆和序列分析基础上研究了不同区段C基因在大肠杆菌中的高效表达,制备了重组抗原。

新型鸭呼肠孤病毒广东分离株σC蛋白基因序列分析

从广东湛江某肉鸭养殖场发生脚软、关节肿大为临床特征和脾脏肿大、肝脏有坏死灶为病变的樱桃谷鸭病料中分离到一株新型鸭呼肠孤病毒,命名为GD693.对新型鸭呼肠孤病毒GD693株σC蛋白基因进行RT-PCR扩增、克隆和测序,并与参考毒株σC蛋白基因序列进行比对分析.结果显示:GD693株与新型呼肠孤病毒(NDRV)代表毒株处于进化树的同一大分支,但却处于一个单独的分支,同属于基因2型,具有相近的遗传演化关系;与NDRV代表毒株091株、TH11株的σC蛋白基因序列进行比较分析,存在核苷酸和氨基酸的序列改变,毒株有可能发生变异或毒力增强.

体外膜氧合联合介入取栓救治蛋白C基因突变所致高危肺栓塞一例

遗传性蛋白C缺陷症是由蛋白C基因突变引起的一种染色体遗传病,可导致静脉血栓形成,多与外显子4~9和内含子8的突变有关。蛋白C基因突变引起的致死性肺栓塞罕见,治疗面临巨大挑战。本文报道1例由蛋白C基因8号外显子移码突变引起的致死性肺栓塞,采用体外膜氧合进行呼吸、循环支持,并成功实行介入取栓的救治经验,为该疾病的诊断及救治提供参考。

两个遗传性蛋白C缺陷症家系的临床特征与基因变异分析

目的:通过分析临床特征和基因变异情况,探讨两个遗传性蛋白C(PC)缺陷症家系与静脉血栓栓塞症(VTE)的关系。方法:回顾性分析2例PC缺陷患者的临床资料。采集2个先证者及各自家系成员(均3代共11人)外周静脉血,检测PC活性、蛋白S活性和抗凝血酶活性等凝血指标。采用PCR法扩增先证者的PROC基因所有外显子及侧翼序列并直接测序。通过软件分析,评估变异位点的保守性和致病性;构建蛋白模型,分析变异前后的空间结构。结果:先证者1临床表现为肺栓塞和下肢深静脉血栓形成(DVT),先证者2为DVT。基因分析显示,先证者1存在c.541T>G杂合错义变异和c.577-579del AAG杂合缺失变异;先证者2存在c.659G>A杂合错义变异。保守性和致病性分析证实,这些变异位点在同源物种氨基酸序列间大部分保守,并均为致病性变异;这些变异导致氨基酸间氢键及侧链基团的改变或产生截短蛋白。结论:c.541T>G杂合错义变异和c.577-579delAAG杂合缺失变异以及c.659G>A杂合错义变异分别与2个先证者PC水平下降有关,可能也是先证者出现VTE的原因之一。

猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析

从人骨骼肌快肌肌钙蛋白C2（TNNC 2）基因出发，在dbEST数据库中进行同源性搜索，找到一个有较高同源性且在猪背最长肌中表达EST（BM083186）。通过电子克隆和进一步RT-PCR实验验证，获得猪TNNC 2基因全长cDNA序列，其全长843bp，开放阅读框为201-683bp，编码有160个氨基酸。同源性分析结果表明，与人、鼠的骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为93．6％、90．5％，蛋白序列同源性均为97．5％。多种组织的半定量RT-PCR研究表明，该基因在骨骼肌中表达，并且在杜洛克猪背最长肌中的表达比兰塘猪高。

中国人内源性高甘油三酯血症患者载脂蛋白CⅢ基因SstⅠ酶切位点多态性的研究

目的 探讨中国人内源性高甘油三酯血症 (HTG)患者血脂及载脂蛋白的改变是否与 apo C 基因 Sst 酶切位点多态性有关。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)对 176例 HTG患者及 199例正常对照 apo C 基因 Sst 酶切位点的限制性片段长度多态性 (RFL P)进行研究。血脂用酶法 ,血清 apo A 、A 、B10 0、C 、C 及 E用 RID试剂盒测定。结果 HTG患者和正常对照组 apo C 基因均以 S1等位基因为主 ,S2等位基因少见 ,其频率显著高于白种人 (0 .2 89vs0 .0 6～ 0 .16 ,P<0 .0 5 )。正常对照组和 HTG组 S2等位基因频率分别为 0 .2 89和 0 .2 87,两者无显著差异 (P>0 .0 5 )。apo C 基因 S2 S2基因型者血脂、载脂蛋白水平与 S1S1者无显著差异。结论 未发现apo C 基因 Sst 酶切位点的 RFL P与中国人 HTG有关联。

FMDV 3C蛋白酶基因的克隆及在昆虫细胞中的表达

口蹄疫病毒3C蛋白酶在病毒的致病机理、聚蛋白前体的加工和RNA的复制上起着很重要的作用,是当前抗病毒研究的一个重要靶点。本研究从AsiaⅠ型FMDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增3C基因,首先克隆到pGEM-T载体,再亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB中,构建出重组转移载体pMel-3C。最后将含有目的基因的转移载体与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以10个MOI感染Sf9细胞,接种病毒72h后收获细胞,样品经SDS-PAGE和Westernblot证实3C蛋白获得表达,分子量约23kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。本研究为空衣壳的体外组装及新型抗病毒药物设计的研究奠定了基础。

载脂蛋白C3基因多态性-482C>T与血浆脂质的关系

目的研究载脂蛋白C3基因上游调控区内-482C>T多态性位点与血浆脂质以及载脂蛋白水平的关系。方法应用聚合酶链反应—限制片长多态性方法逐个鉴定每个个体的基因型,并测定其血浆脂质和载脂蛋白水平。结果-482T等位基因携带者具有较高的甘油三酯水平(P=0.044);同时该等位基因的携带者也具有较高的载脂蛋白C2水平(P=0.017)。结论载脂蛋白C3基因-482C>T位点和血浆甘油三酯以及其它几种脂蛋白密切相关。

拟南芥3个蛋白磷酸酶2C基因编码蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

利用gateway技术从拟南芥中克隆了3个蛋白磷酸酶2C基因At5G66080、At1G68410和At5G06750,3个基因的ORF全长分别为1 158 bp、1 311 bp和1 182 bp,分别编码一条385、376和393个氨基酸残基的多肽.构建了3个基因的植物表达载体35S:GFP:At5G66080、35S:GFP:At1G68410和35S:GFP:At5G06750,采用基因枪法进行的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,荧光信号主要分布在细胞核上,显示这3个基因的产物可能在细胞核上发挥作用.利用实时荧光定量PCR研究At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在不同组织中的表达特性,结果表明:3个基因在各个器官均有表达,但表达量不同;At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在花中表达量最大;At5G66080和At5G06750基因在根、叶和叶柄中的表达量次之,在茎中的表达量最低;At1G68410基因在根中的表达量次之,在茎、叶和叶柄中的表达量较低.

家蚕蛋白激酶C受体基因(Bmrack)的克隆及序列分析

蛋白激酶C受体蛋白(RACK)除作为细胞内蛋白激酶C的受体之外,还作为细胞内重要的支架蛋白调节细胞功能。应用生物信息学方法对家蚕RACK蛋白的编码基因Bmrack进行电子克隆,获得了1224 bp的重组序列,基因编码区长960 bp,编码319个氨基酸,蛋白分子质量为36.04 kD,等电点为8.07。从家蚕幼虫脂肪体基因组DNA中PCR克隆了Bmrack基因,序列总长为2 122 bp,含有4个内含子和5个外显子,通过家蚕WGS比对,结果与其中5条序列的一致性为99%,且修复了其中8个缺口。聚类分析表明RACK蛋白的氨基酸序列在鳞翅目昆虫中非常保守。

胃蛋白酶原C基因多态性在胃癌家系成员中的分布

目的 通过PCR方法检测胃蛋白酶原C基因(pepsinogen C gene,PGC gene)多态在辽宁庄河地区胃癌家系成员基因组中的分布,并进一步分析遗传因素对庄河地区胃癌发生的影响。方法 研究材料为61例胃癌家系成员外周血及42例健康人外周血,通过PCR方法检测胃蛋白酶原C基因多态性。结果 与正常对照组比较,胃癌家系成员组等位基因1出现的频率(0.564)较正常组(0.3659)高且有统计学意义(X^2=5.09,p<0.05)。等位基因1纯合基因型在胃癌家系成员组中的分布频率为0.36,较正常组(0.15)高且有统计学意义(x^2=5.65,p<0.05)。结论 庄河地区胃癌家系高发胃癌与PGC多态有关。本实验结果说明该地区胃癌高发的原因不仅与环境因素有关,而且与遗传因素有关。

载脂蛋白C3基因多态性与男性超重及肥胖的关系

目的分析探讨载脂蛋白C3基因C3175G多态性与男性超重及肥胖的关系,以及超重和肥胖的危险因素。方法采用病例对照研究方法,调查了重庆市某医院338名男性门诊病人和健康体检者,以体质指数作为肥胖的评价指标,获得超重及肥胖患者184人,体质指数正常者(对照组)154人,选择健康人和肥胖患者载脂蛋白C3(ApoC3),检测3175位核苷酸C→G多态性,并对其血脂水平进行比较。结果该人群CC、CG、GG的基因型频率分布分别为51.78%、39.94%和8.28%,C和G等位基因频率分布分别为71.75%和28.25%。超重及肥胖组CC、CG、GG基因型频率分别为47.28%、44.57%和8.15%,对照组分别为为57.14%、34.42%和8.44%;超重及肥胖组C等位基因和G等位基因频率分别为69.57%和30.43%,对照组分别为74.35%和25.65%,其差异经检验均无统计学意义。除腰臀比及甘油三酯在对照组内C3175G不同基因型间差异有统计学意义外,体重、身高、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白在超重及肥胖组和对照组的差异均无统计学意义(P>0.05);非条件Logistic回归分析提示,甘油三酯偏高是肥胖的危险因素。结论载脂蛋白C3基因C3175G可能与男性超重及肥胖的发生无关。

南京地区汉族腔隙性脑梗死患者蛋白激酶Cη基因多态性的研究

目的探讨南京地区汉族腔隙性脑梗死患者蛋白激酶Cη(PRKCH)基因rs3783799位点和rs2230500位点的单核苷酸多态性(SNPs)。方法采用PCR和连接酶反应(LDR)技术,检测272例南京地区汉族腔隙性脑梗死患者(腔梗组)和296例非腔隙性脑梗死患者(对照组)PRKCH基因的SNPs。比较两组基因型分布和等位基因频率,并对PRKCH基因rs3783799位点和rs2230500位点进行配对连锁不平衡分析及单倍体型分析。结果腔梗组PRKCH基因rs3783799位点基因型分布[G/G型268例(98.5%),G/A型4例(1.5%)]及A等位基因频率(0.7%)与对照组[G/G型292例(98.6%),G/A型4例(1.4%);0.7%]比较的差异无统计学意义;腔梗组PRKCH基因rs2230500位点基因型分布[G/G型266例(97.8%),G/A型6例(2.2%)]及A等位基因频率(1.1%)与对照组[G/G型290例(98.0%),G/A型6例(2.0%);1.0%]比较的差异亦无统计学意义。单倍体型分析显示,两位点配对单倍体型G/G分布频率在腔梗组为98.9%,在对照组为98.6%,两组间比较的差异无统计学意义。结论 PRKCH基因rs3783799位点和rs2230500位点基因多态性可能与南京地区汉族人群腔隙性脑梗死的发病无关。

血小板膜糖蛋白基因Ia C807T多态性与缺血性脑卒中关系的Meta分析

目的 运用系统评价和Meta分析评估血小板膜糖蛋白（GP）基因C807T变异和缺血性脑卒中（IS）之间的相关关系.方法 广泛检索中英文数据库中的相关研究,对符合纳入标准的每个研究提取等位基因和基因型频率,纳入研究的质量采用NOS量表评估.使用随机或固定效应模型计算比值比（OR）,使用Q检验检测各研究之间的异质性,运用Meta回归分析方法探讨异质性的可能来源,Egger＇s（埃格）测试和漏斗图评估发表偏倚.结果 总共15个研究纳入Meta分析.发现GP Ⅰa C807T多态性T等位基因或TT基因型增加了亚洲人对IS的易感性（807T等位基因：OR 1.31,95％CI为1.15～1.50,P＜0.0001;807TT基因型：OR1.44,95％CI为1.09～1.88,P=0.009）.结论 现有证据表明,GPⅠa-807 T等位基因或TT基因型增加了IS的发病风险.但该结论仍需大样本研究在不同人种中进一步验证,也应分析基因与基因、基因与环境间的交互作用.

缺血性脑血管病患者半胱氨酸蛋白酶抑制因子C基因多态性临床研究

目的探讨半胱氨酸蛋白酶抑制因子C(Cys C)基因CST3 G73A多态性与缺血性脑血管病(ICVD)的关系。方法选取确诊为缺血性脑血管病患者120例(病例组)及100例非ICVD对照人群(对照组)作为研究对象,采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测其Cys C基因G73A位点的多态性分布。结果 CST3扩增产物片段长度为557bp,在酶切后,可产生野生GG型、突变杂合子GA型及突变纯合子AA型3种基因型。病例组GG、GA和AA等3种基因型频率分别为59.17%、28.33%及12.50%,对照组分别为60.00%、24.00%及16.00%;病例组G及A等位基因频率分别为75.42%及24.58%,对照组分别为78.50%及21.50%,2组基因型频率及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Cys C基因G73A位点多态性可能与脑缺血性脑血管病发病无关,需大样本研究进一步证实。

江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因的克隆及测序

从江浙蝮蛇毒腺中抽提总RNA,RT—PCR进行体外扩增,获得江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子基因,克隆至pGEX-5X-3载体中.对3个重组克隆分别作DNA全序列分析.通过遗传密码推导出相应的氨基酸序列.与其它已知的丝氧酸蛋白酶型蛇毒蛋白的氨基酸作比较,其中许多位置上氨基酸有很强的同源性.该基因的成功克隆,不仅推导出江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子的蛋白质序列,也为进一步开展江浙蝮蛇蛇毒蛋白C激活因子蛋白质工程的研究工作打下良好的基础.