蓝舌病病毒vp7基因的表达及其产物在c-ELISA中的应用

获得稳定、高效的具有良好抗原性的蓝舌病毒(Bluetonguevirus,BTV)vp7基因重组抗原。将BTV编码群特异性抗原VP7的S7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中,构建S7克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。与已报道的多株BTV编码VP7的基因比较后发现,所测定毒株的核苷酸序列与BTV10型的S7基因同源性高达98.7%,推测的氨基酸同源性为99.3%,证实为BTV的S7基因。然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,转化LGM194细胞,经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得BTVS7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体。经L-araboinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP7蛋白抗原。SDS-PAGE、ELISA试验表明,表达蛋白为融合蛋白,具有反应原性,分子量约54.5kD,重组蛋白的获得率为1.52mg/g湿菌,其表达产量约占菌体总蛋白的12%左右,相当于93.5mg/L菌液。融合蛋白中含有BTVVP7特异性蛋白抗原,可作为c-ELISA包被抗原,为蓝舌病的免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础。

2种小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒的比较分析

小反刍兽疫YN PPRV C-ELISA抗体检测试剂盒由云南省出入境检验检疫技术中心自主研发,采用这一试剂盒与法国IDVET研制的小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒,分别对田间牛羊的661份血清样本进行对比检测试验,并使用YNPPRV C-ELISA抗体检测试剂盒对15份检出的已知背景血清进行批内和批间可重复性试验。结果显示自行研制试剂盒相对国际通用试剂盒ID VET PPRV C-ELISA的特异性、敏感性、符合率分别达到97.96%、97.82%和98.34%,两者一致性用Kappa值表示,Kappa=0.97。批内试验强阳性、弱阳性变异系数为0%～0.05%。结果表明,YN PPRV C-ELISA抗体检测试剂盒的敏感性、特异性、批内和批间重复性均较高,具有高度的可靠性,在小反刍兽疫的诊断检测中具有良好的实用价值。

C-ELISA技术简介

C-ELISA(Cloth-ELISA)是加拿大学者Blais,B.W.等1989年建立的一种新型免疫测定技术,可译为布-酶联免疫吸附试验。这种技术是以疏水性聚酯布(Hgdrophobic PolyesterCloth)即涤伦布为固相载体,这种大孔径的疏水布具有吸附样品量大,可为免疫反应提供较大的表面积,提高反应的敏感性,且容易洗涤,不需特殊仪器等优点,为免疫诊断提供了一种简单快速、成本低廉的检测方法。现以对布氏杆菌抗原的检测为例将其简介如下。

流行性出血病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立

为能简便、快速地进行流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)抗体监测,采用纯化的6型EHDV抗原包被ELISA板,以豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测EHDV群特异性抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示:抗原最佳包被浓度为5.12μg·mL-1(1∶10 000),竞争抗体最佳稀释倍数为1∶10 000;通过对各270份阴性和阳性的牛、羊血清检测,确定该检测方法临界值为50%;特异性试验表明该ELISA方法仅能检测出不同血清型EHDV抗体,具有较好的群特异性;对已知抗体效价的阳性血清检测表明,建立的C-ELISA方法敏感性好于血清中和试验(SNT)和琼脂扩散试验(AGID);分别用C-ELISA、SNT、RTPCR和病毒分离试验对监控动物采集的血清和抗凝血样品进行检测,ELISA结果与其他3种方法检测结果对应一致。结果表明本研究建立的C-ELISA为EHDV抗体的检测提供了一种快速、敏感、稳定的方法。

蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立和比较研究

为建立一种检测成本低、操作简便的蓝舌病血清抗体监测方法,本研究通过制备群特异性的蓝舌病多克隆检测抗体和优化抗原固定技术,建立了蓝舌病多克隆抗体C-ELISA检测方法。通过对150份牛羊已知阴性血清的检测确定该检测方法的cut-off值为40%;对58份已知阳性血清样品同时进行中和实验和C-ELISA检测,检测结果经SPSS软件进行t检测统计分析,Sig.(双侧)=0.651,相关性0.912,相关性显著。对24个BTV血清型阳性血清,2份牛BVD阳性血清,2份羊口蹄疫阳性血清,2份羊痘阳性血清进行检测。结果表明,24个BTV血清型阳性血清为阳性,其他血清全部为阴性。对150份已知阴性血清和55份已知阳性血清用中和试验、美国VMRD公司试剂盒和本方法分别进行检测。结果表明,本检测方法与中和试验检测结果符合率达100%,进口试剂盒符合率为96.7%。

MAb-C-ELISA法检测绵羊布氏杆菌抗体

法国Debbarh等（1996）应用布氏杆菌BP26（一种胞质蛋白抗原）特异的15株单克隆抗体（MAb）竞争ELISA（C-ELISA）,对自然感染、马岛热布氏杆菌H38实验感染以及马岛热布氏杆菌Rev.1疫苗免疫的绵羊检测其抗体。结果血清学和细菌学阳性绵羊中有90％为C-ELISA阳性。

用C-ELISA检测鸸鹋的AIV抗体

最近,加拿大的研究人员用竞争ELISA(C-ELISA)、琼脂凝胶免疫扩散(AGID)和血凝抑制(HI)试验测定了鸸鹋对AIV感染的抗体反应。3组鸸鹋每组4只分别用AIVH5N1、H5N3和H7N7感染,第4组2只鸵鸟用新城疫病毒(NDV)感染。感染后7天,用C-ELISA可以检出抗AIVH5N1、

酶联免疫法测定甘精胰岛素中单链前体残留研究

目的 建立酶联免疫法检测甘精胰岛素中单链前体残留,为甘精胰岛素药物质量控制和安全性评价提供新方法。方法采用双抗夹心酶联免疫法,以甘精胰岛素原为标准品,建立单链前体残留检测方法,验证方法的重复性、准确度、范围和精密度,并应用该方法检测9批甘精胰岛素原料药。结果在0.156~10.00 ng·mL^(-1)浓度范围内,对甘精胰岛素原标准品进行四参数曲线拟合,曲线相关系数R~2大于0.99,方法准确度较高、重复性良好。重复检测3批甘精胰岛素原料药,平均加标回收率在104%~113%范围内,RSD%小于10%,方法精密度良好。9批样品中单链前体残留量均小于1 ng·mg^(-1)。结论建立的酶联免疫法可用于甘精胰岛素及其他重组人胰岛素类似物中单链前体残留量的质量控制和安全性评价。

2022年云南省边境地区牛蓝舌病病毒及阿卡斑病毒抗体检测

为了解云南省边境地区牛蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)与阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)的流行与分布现状,2022年在云南省9个边境县(市)采集1 820份牛血清样本,应用c ELISA方法进行BTV与AKAV抗体检测,并对检测结果利用IBM SPSS Statistics 22、Excel 2007等软件进行区间、群间和时间的分类统计分析。结果显示:共检出BTV阳性样品1 207份,样品阳性率为66.32%(1 207/1 820);检出AKAV阳性样品350份,样品阳性率为32.17%(350/1 088)。各县(市、区)的BTV样品阳性率为43.50%~93.00%,AKAV为12.90%~50.00%,不同地区间的差异有统计学意义(P <0.01);黄牛和西门塔尔牛的BTV和AKAV抗体样品阳性率均高于水牛,入境牛BTV抗体阳性率显著高于本土牛,两组数据差异均有统计学意义(P <0.01);规模养殖场的BTV和AKAV抗体阳性率和散养户差异无统计学意义(P> 0.05);7-8月的BTV和AKAV抗体阳性率显著高于5-6月(P <0.01)。结果表明:BTV和AKAV在云南省边境地区已广泛存在,其感染有加重趋势;病原通过境外牛传入国内的风险不断增加,防控形势较为严峻。因此,云南省应继续加强边境地区BTV、AKAV等虫媒病毒的监控,并制定实施相应防控措施,以保障国内畜牧业健康发展。

竞争酶联免疫吸附试验检测蓝舌病抗体的研究

用已研制的 BTV-1 1型 VP7单克隆抗体建立了竞争酶联免疫吸附试验 ( C-ELISA)检测蓝舌病抗体的方法 ,并与琼脂免疫扩散试验( AGID)进行了检测比较 ,C-ELISA特异性强 ,不与相关环状病毒发生交叉反应 ,敏感性比AGID高。用研究制备的 C-ELISA诊断试剂盒和美国、澳大利亚制备的诊断试剂盒对 1 3 77份临床样品的检测 ,以及对实验动物人工感染后抗体动态检测。三种诊断试剂盒检测结果一致 ,且重复性好。本研究建立的蓝舌病 C-EL ISA是一种特异性强、敏感性高的蓝舌病抗体检测方法。

山西省羊蓝舌病防控技术的研究应用

利用分离鉴定的I型蓝舌病 (BIV、I型 )地方毒株和16型毒株研制弱毒疫苗 ,对重点地区实行免疫接种 ,并用c -ELISA进行免疫监测表明 ,抗体阳性率高达70.1 %。适时提出抓种畜检疫 ,净化 ,限制疫点畜群流动 ,大力开展产地检疫 ,搞好季节灭蠓 ,加强环境消毒 ,布点放置哨兵羊等 ,建立起一整套动物蓝舌病综合防控技术体系 ,为控制动物蓝舌病奠定了基础。

布鲁菌病血清学检测方法的比较

[目的]比较4种布鲁菌病的血清学检测方法。[方法]分别用虎红平板凝集试验(RBT)、间接酶联免疫吸附试验(i-ELISA)、竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)、试管凝集试验(SAT)4种方法检测876份奶牛血清。[结果]RBT、i-ELISA、SAT、c-ELISA检出的阳性血清分别为543份、501份、460份、500份,阳性率分别是61.99%、57.19%、52.51%、57.08%。

牛奶中孕酮直接竞争ELISA检测方法的建立

采用直接竞争ELISA方法检测牛奶中孕酮含量。采用碳化二亚胺法，应用辣根过氧化物酶（HRP）标记11-α羟基孕酮琥珀酸酯（11α—OH—P4-HS），制备孕酮酶标抗原；酶标抗原与牛奶样品中的孕酮共同竞争结合固相包被的孕酮单克隆抗体，建立直接竞争ELISA反应体系。试验结果表明，最佳抗体包被浓度为1：2000，最佳酶标抗原工作浓度为1：16000，建立的标准曲线为y=-2．4598x＋0．999（R^2=0．996），牛奶中孕酮检测范围0．12-40ng／mL，最低检测量为0．12ng／mL，批内和批间变异系数分别为1．63％和2．49％。成功建立了可用于牛乳中孕酮快速检测的直接竞争ELISA方法。

蓝舌病病毒人工感染绵羊抗体的监测及分型血清的制备

用由南非蓝舌病国际研究中心引进的8个不同血清型蓝舌病标准病毒,经vero细胞复壮三代,离心纯化,测定毒价后作为免疫原。取16只健康绵羊,分成8组,每组2只,采用这8种不同血清型的细胞毒分别按静脉3ml/只、肘后皮下2ml/只多点注射,5天后按3ml/只自血移植的免疫程序人工感染。采用竞争性酶联免疫吸附试验(C-ELISA)监测感染绵羊的抗体产生水平,制备标准分型血清。监测结果表明,初免后28天,除BTV-19呈弱阳性外,其余7型均呈强阳性,且抗体产生总体呈上升趋势。在此基础上制备出抗BTV的分型血清。

应用单抗竞争ELISA快速检测肠炎沙门氏菌

本研究应用抗肠炎沙门氏菌 O9抗原的酶标单抗 3- 4 7- 2 6和肠炎沙门氏菌脂多糖( LPS)建立了快速检测肠炎沙门氏菌的竞争ELISA方法 ,该法通过样品中的肠炎沙门氏菌 L PS与微量板包被的肠炎沙门氏菌 LPS竞争结合酶标抗体 ,以检测样品中的肠炎沙门氏菌。通过与国标法对样品的比较检测结果表明 ,该法可检测出每克粪便中 5×1 0 4 CFU的肠炎沙门氏菌 ,国标法可检出 4.9× 1 0 1 CFU/g粪便。竞争 EL ISA( C- ELISA)方法的敏感性和特异性分别为 94.4%和 97.7%。

新疆喀什部分地区驴梨形虫病检测初报

为了解新疆维吾尔自治区南疆部分地方驴泰勒虫和驽巴贝斯虫病的存在情况,本文采用PCR技术和竞争性酶联免疫吸附试验(c-ELISA)检测喀什部分地区驴泰勒虫病和驽巴贝斯虫病的流行情况。调查结果显示,喀什地区疏勒县和疏附县驴寄生虫总感染率为45.17%。通过PCR方法检测出19份血样感染泰勒虫病,感染率为36.84%;未检出驽巴贝斯虫病。通过c-ELISA方法检测出96份血清感染泰勒虫病,感染率为7.29%;驽巴贝斯虫的感染率为1.04%。通过本次驴寄生虫感染调查,对喀什部分地区驴寄生虫感染情况有了初步了解,为该地区驴的健康发展提供了科学依据。

我国牛羊中山病血清学调查

为了解中山病在我国的流行和分布情况,本研究采用竞争ELISA检测方法,对2016-2018年我国吉林、辽宁、内蒙古、河北、新疆、西藏、湖北、重庆、四川、贵州、云南、广西和广东13个省级区划的8 232份牛羊血清进行检测。结果显示,有12个省级区划检测出抗体阳性,且阳性率有明显的地域性和季节性,由北向南逐渐升高(0~74.03%),秋季阳性率(2.50%~60.00%)明显高于春季(0~10.00%)和夏季(2.22%~35.00%)。乌兰察布、哈密、河池和曲靖等4个采样点的牛羊血清检测发现,牛血清抗体阳性率均高于山羊和绵羊血清。以上结果表明中山病在我国的流行已具有广泛性,流行分布状况与其媒介昆虫的活动有密切关系,并且牛比羊更易被该病毒感染,同时本研究的试验数据将有助于我国更好地了解和防控中山病。

2013年内蒙古地区蓝舌病流行情况调查

为了解内蒙古地区蓝舌病(BT)流行情况,本研究于2013年对内蒙古存在疑似BT病例地区进行流行病学调查,收集了内蒙古6个盟市不同种类动物的抗凝血及其对应血清样品212份,采用竞争ELISA及套式RT-PCR方法对样品进行检测。竞争ELISA检测结果显示212份血清样品中有63份为BT阳性样品,13份为BT弱阳性,总阳性率为35.85%(76/212)。套式RT-PCR检测结果显示212份血液样品中有61份为BT阳性样品,总阳性率为28.77%(61/212),其中绵羊感染率为21.25%(17/80)、绒山羊感染率为35.35%(41/116)、牛感染率为18.75%(3/16)。不同的饲养方式对动物感染BT也有影响,其中圈养感染率为16.67%(1/6),散养感染率为29.13%(60/206)。本研究结果表明,内蒙古地区BT流行范围比较广泛,因此有必要加强该病的检测及预防。

急性心肌梗塞病人血清巯基蛋白酶抑制肽C的变化

采用兔抗人ＣｙｓｔａｔｉｎＣ抗体建立了酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）技术，对急性心肌梗塞病人急性发作期、恢复期及正常对照进行了测定。发现心梗急性发作期和恢复期血清ｃｙｓｔａｔｉｎＣ含量无明显变化，但均明显低于对照（Ｐ＜０．０ｌ）。用Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归模型校正年龄因素的影响后，上述差别仍然显著（Ｐ＝０．０４１）。提示血清ｃｙｓｔａｔｉｎＣ浓度变化在一定程度上可作为急性心肌梗塞诊断的参考指标。此检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好。

Asia Ⅰ口蹄疫vp2蛋白单克隆抗体的制备及单抗竞争ELISA方法的建立

制备AsiaI口蹄疫病毒vp2单克隆抗体(mAb)并建立了单抗竞争ELISA方法。用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒vp2重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞。分别用ELISA、Western blotting检测mAb腹水的效价及其特异性。筛选到杂交瘤细胞2株,腹水效价均在100×29以上;以纯化后的AsiaI型口蹄疫病毒vp2重组蛋白作为抗原,利用AsiaI型口蹄疫病毒vp2单抗酶标物建立了竞争ELISA方法用来检测AsiaI型口蹄疫抗体。临床应用表明,该方法与UBI公司的口蹄疫全病毒抗体检测试剂盒总符合率达89.0%,和荷兰赛迪公司的口蹄疫病毒LPB-ELISA抗体检测试剂盒总符合率达86.5%。