新生隐球菌格鲁比变种国内菌株的多位点微卫星灶分型

目的应用多位点微卫星灶分型(MLMT)对国内6个城市分离出的新生隐球菌格鲁比变种(Cryptococcus neo-formans var.grubii)进行基因分型,了解该变种的国内基因型分布特征。方法提取已鉴定的43株新生隐球菌格鲁比变种DNA,用PCR对3个微卫星位点(CNG1,CNG2,CNG3)的基因片段进行扩增后测序。再计算每一菌株位点基序重复数(CNG1对应TA重复,CNG2对应GA重复,CNG3对应CAT重复);据基序重复数判定各菌株的基因型。结果所有43株菌中,MLMT-17型占83.72%,该型在临床和环境的菌株中分别占86.67%和70%。MLMT-39、-40是新发现的基因型。结论在我国,MLMT-17是最常见的新生隐球菌格鲁比变种基因型,普遍存在于临床和环境菌株中,表明国内临床新生隐球菌病的感染菌株主要源于本土环境菌株。

华东地区新生隐球菌药物敏感性分析

目的探索近年来华东地区分离的新生隐球菌临床株对常用抗真菌药物的体外敏感性。方法采用美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的M27-A3肉汤微量稀释法检测氟康唑、氟胞嘧啶、两性霉素B、伊曲康唑和伏立康唑对新生隐球菌临床分离株的最低抑菌浓度（MIC）范围,并通过内转录间隔区（ITS）测序法对检测出的耐药和剂量依赖性敏感（SDD）菌株进行进一步鉴定。结果抗真菌药物对96株新生隐球菌的MIC90（MIC范围）为：氟康唑4（0.5~16）μg/m L,氟胞嘧啶4（0.25~64）μg/m L,两性霉素B 0.5（0.03~1）μg/m L,伊曲康唑0.5（0.03~1）μg/m L,伏立康唑0.25（0.03~0.5）μg/m L,所有耐药菌株及SDD菌株的分子鉴定均为新生隐球菌格鲁比变种。结论除伊曲康唑外,华东地区新生隐球菌临床株对抗真菌药物的敏感性高,耐药菌株少,不敏感株以新生隐球菌格鲁比变种为主。

新生隐球菌格鲁比变种临床株与环境株微卫星基因型的小鼠毒力实验研究

目的了解巴西新生隐球菌格鲁比变种（C.neoformans var．grubii）多位点微卫星定型（ multilocus microsatllite typing, MLMT）在临床和环境中的分布特点，探讨不同微卫星型的新生隐球菌格鲁比变种临床株和环境株的毒力差异。方法根据多位点微卫星分型技术对分离自巴西的40株（17株临床株和23株环境株）新生隐球菌格鲁比变种进行分型，筛选出临床株及环境株中分布占优势的菌株，应用小鼠毒力试验分别对其进行毒力检测，通过发病情况及病理切片比较毒力差异。结果40株格鲁比变种共鉴定出11种微卫星型，临床株中的优势菌株为MLMT-13型，共9株，占临床株的52．9％（9／17），环境株中的优势菌株为MLMT－36型，共10株，占环境株的43．5％（10／23）；小鼠毒力试验结果显示MLMT－13型感染小鼠后发病率为100％，而MLMT－36型发病率为7．5％，且病理结果也存在明显差异。结论格鲁比变种在从环境迁徙到宿主的过程中，毒力随环境的变化发生了改变，该变化也可在其微卫星重复序列上体现出来。该实验证明新生隐球菌格鲁比变种的分布及来源与微卫星型之间存在相关性，临床株MLMT-13型和环境株MLMT－36型之间存在着显著毒力差异。

新生隐球菌毒力差异菌株的全基因组测序及毒力相关基因的筛选

目的了解及分析新生隐球菌格鲁比变种（Cryptococcus neoformans var grubii）两组毒力差异明显的多位点微卫星型（multilocus microsatellite typing，MLMT）菌株的全基因组序列，筛选出引起其毒力差异的相关基因。方法选取毒力差异最为明显的不同基因型菌株各1株进行全基因组重测序，运用比较基因组学方法全面分析测序结果，使用非同义SNPs（non-synonymous SNPs，nsSNPs）、无义突变SNPs、产生移码突变InDels的策略广泛筛选差异基因。对筛选出的基因在所有实验菌株中进行DNA测序验证，并提取总RNA，采用快速扩增5’和3’cDNA末端（rapidamplificationof5’and3’cDNAends，RACE）技术，克隆后测序获得对应基因的完整cDNA全长序列信息。结果通过全基因组重测序，环境株IFM56731和临床株IFM56800均分别获得127倍和111倍覆盖率的有效数据。分别对SNPs和InDels数据进行统计分析，应用无义突变SNPs和产生移码突变的InDel分别筛选出3个差异基因。对筛选出的6个基因在所有实验菌株中进行扩增测序，并对其中3个基因进行cDNA的测序分析，最终确定基因CNAG_01032的转录序列位置和结构，并验证了预测的无义突变位点存在于实际的mRNA中。结论本研究通过全基因重测序数据分析证明，应用无义突变SNPs和产生移码突变的InDels进行差异基因筛选的策略具有较好针对性，并筛选出6个潜在与毒力相关的基因，通过对所有实验菌株的测序和对全长cDNA的测序验证，最终筛选出基因CNAG一01032为可能引起菌株毒力差异的基因。