人血浆C1酯酶抑制剂测定试剂(免疫透射比浊法)的研制及评价

建立一种人血浆C1酯酶抑制剂的免疫透射比浊分析方法。制备C1酯酶抑制剂检测试剂,并用日立7180全自动生化仪对自制试剂的各项性能指标进行评价。结果 C1酯酶抑制剂试剂的灵敏度吸光度ΔA为0.287/400mg/L, 准确度偏差<5%,批内精密度<5%、批间精密度<10%。C1抑制剂检测低限为15.15mg/L;生物检测限为25mg/L;在25~1000mg/L测定范围内线性相关系数(r)为0.9993。样本中血红蛋白≦6g/L、胆红素≦400μmol/L、甘油三酯≦6g/L、RF≦600U/mL时对检测结果无明显影响,自制试剂盒与进口Dialab试剂盒相关系数为0.9988。 结论 自研C1酯酶抑制剂测定试剂(免疫透射比浊法)各项指标均达到临床检测要求,与进口Dialab同类试剂测定结果有良好的相关性,具有能自动化快速检测、准确度高、精密度好的特点,有较好的临床应用前景和应用价值。

C1酯酶抑制剂在危重病中的应用研究进展

C1酯酶抑制剂（C1 INH）是血浆中的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,是目前已知的惟一能与丝氨酸蛋白酶C1s和C1r作用的抑制剂,也是激肽释放酶、活化的凝血因子FXⅡ（FXⅡa）、活化的凝血因子FXⅠ （FXⅠ a）的抑制剂.C1 INH是血浆中高度糖基化的单链糖蛋白,由478个氨基酸残基组成,蛋白质含量为51％,分子量约为104 kDa,共含有20个糖基化位点,位于ASN-330位点的糖基化结构对丝氨酸蛋白酶抑制区折叠效应的形成起重要作用[1].目前,一般将C1 INH分为丝氨酸蛋白酶抑制区和非蛋白酶抑制区两个区域.在分子结构上,蛋白酶抑制区具有9个α螺旋和3个β折叠[2].C1 INH主要在肝脏中合成,其他一些细胞（如单核细胞、巨噬细胞、血小板等）也具有合成能力.在补体系统中,C1 INH主要调节补体的经典活化途径,还可以与C3反应抑制C3b与B因子的结合,从而调节补体的旁路途径.在缓激肽释放系统中,C1 INH是FXⅡa的主要灭活剂,也抑制血浆中激肽释放酶的活性,还抑制前激肽释放酶对HK辅因子的裂解,从而抑制激肽的形成和释放,间接调节缓激肽的水平[3].在遗传性血管性水肿患者的急性发作期,激肽释放酶和FXⅡa直接活化纤维蛋白溶酶原,增强纤溶系统的活化,因此C1 INH对于纤溶系统的活化也具有调节作用.C1 INH还可以灭活47％的FXⅠ a[4],因此可以调节机体的内源性凝血系统.

C_1^-酯酶抑制剂(C_1^--INH)的研究进展

C_1^--INH是属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(即属于Serpin基因家族),含糖量高,为单一多肽链。活性中心位于C^-端。有8种变异型。先天性缺乏C_1~1-INH主要见于遗传性血管神经性水肿。某些严重疾病也会造成后天性C_1^--INH缺乏症。另一些病也会使血液中C_1^--INH含量升高。现发现体内至少有4种细胞合成和分泌C_1^--INH,C_1^--INH基因位于第11条染色体上,具有限制性片断长度多态性。除用同化激素外,C_1^--INH浓制剂、干扰素以及肿瘤坏死因子在治疗和预防C_1^--INH缺乏症方面有很好的效果。

C1酯酶抑制剂分离纯化工艺研究

目的 研究以人凝血酶原复合物(PCC)制备过程废弃洗涤液为原料分离纯化C1酯酶抑制剂(C1-esterase inhibitor, C1-INH)的工艺。方法 通过聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)4000沉淀及阳离子层析两步法分离纯化C1-INH。调整原料pH及PEG4000浓度考察PEG4000沉淀法最佳条件;PEG沉淀后离心,上清液处理后作为阳离子交换层析的上样液,使用Fractogel EMD SE HiCap(M)凝胶及CM Sepharose FF凝胶进行离子交换层析,通过比较C1-INH活性收率及比活性选择最适合的凝胶及分离条件。结果 在pH6.1的条件下,PEG4000质量分数14%时,搅拌10min后离心,C1酯酶抑制剂回收率≈70%,铜蓝蛋白(ceruloplasmin, CER)去除率>95%;使用Fractogel EMD SE HiCap(M)凝胶进行阳离子交换层析,洗脱液盐浓度为0.25M氯化钠时,C1酯酶抑制剂活性收率>80%,比活性>5IU/mg。结论 以PCC制备过程中废弃洗涤液为原料,经过PEG沉淀和Fractogel EMD SE HiCap(M)离子交换层析纯化制备能够得到高比活性的C1酯酶抑制剂。

紫外-可见分光光度法检测高纯度人C1酯酶抑制剂蛋白质含量的经验公式

目的建立高纯度人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH)蛋白质含量(质量浓度)检测的紫外-可见光分光光度法(简称A_(280 nm)法),得到双对数方程的经验公式,用于C1-INH精纯阶段含目标蛋白样品的蛋白质含量在线检测。方法以1批高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度98.49%的C1-INH原液作为对照品,用注射用水稀释获得不同质量浓度的稀释品,分别检测稀释品A_(280 nm)值,以稀释品的A_(280 nm)值与理论质量浓度进行不同方程的线性拟合,选取回收率在理论值100%±10%、R^(2)>0.99的质量浓度区间建立最佳拟合方程。在此线性范围内,用原始值和消光值分别拟合得到不同的方程,对2种拟合方程的准确度、精密度和稳定性进行验证。通过原始值均值方程和不同基质液的检测均值来建立经验公式,用该经验公式计算不同批次纯化工艺中间样品的蛋白质质量浓度并与免疫比浊法和凯氏定氮法的检测结果进行比较,确定其准确性。用该经验公式指导C1-INH精纯样品的检测。结果建立的A_(280 nm)法采用双对数方程拟合标准曲线的线性范围为0.214~3.567 mg/mL;在此线性范围内,用原始值和消光值分别拟合双对数方程,2个标准曲线的重复性和稳定性均较好,且高、中、低值质控品及检测下限的准确度(即回收率)<100%±7%,精密度CV<3%。含目标蛋白质的多种基质液按照原始均值方程计算得到对应的蛋白质质量浓度在0.044~0.064 mg/mL,均值为0.051 mg/mL;经验公式为:蛋白质质量浓度x={10(lg(y)+0.3820.764)-0.051}×稀释倍数,用该公式计算的添加了对照品的各基质的回收率在96.636%~109.533%。检测不同批次纯化工艺中间样品的结果显示,对于精纯样品,该经验公式与凯氏定氮法的结果比值在0.93~1.12,免疫比浊法结果与凯氏定氮法的结果比值在1.19~2.33。用该经验公式计算的不同精纯阶段中间样品的结果与凯氏定氮法结果更接近。结论建立的A_(280 nm)法经验公式可用于精纯阶段的高纯度C1-INH样品的蛋白质含量在线快速检测。

重组人C1酯酶抑制剂中异天门冬氨酸含量检测

目的:检测重组人C1酯酶抑制剂(rh C1INH)中异天门冬氨酸(Iso Asp)的含量。方法:采用异天冬氨酸甲基转移酶催化结合反相高效液相色谱的方法进行测定,对该方法进行专属性、准确性和精密度检验,并用该方法对3批样品的Iso Asp含量进行检测。结果:浓度分别为10、30、60 pmol/60μL的SAH标准品的检测结果均在90%～110%范围内。对同一批3个待测样品进行测定,IsoAsp含量为(0.413±0.020)μmol IsoAsp/g rhC1INH,RSD为4.8%,显示该方法具有较好的专属性、准确性和精密度。3批测试样品中,IsoAsp含量分别为0.633、0.827、0.487μmol IsoAsp/g rhC1INH。结论:经方法学验证,异天门冬氨酸检测试剂盒结合RP-HPLC方法适用于rhC1INH中IsoAspr的含量检测,可为类似蛋白制品中该项目的检测提供借鉴。

重组人C1酯酶抑制剂中rcc-rhC1INH和ox-rhC1INH含量检测

目的:分析重组人C1酯酶抑制剂(rhC1INH)中相关蛋白rcc-rhC1INH和ox-rhC1INH的含量。方法:采用反相高效液相色谱法进行测定,对该方法进行专属性、准确性和精密度检验,并用该方法对4批样品中的相关蛋白进行检测。结果:低浓度下,rhC1INH对照品、rcc-rhC1INH对照品和ox-rhC1INH对照品能够较好分离。rcc-rhC1INH和ox-rhC1INH 2种对照品质量浓度为0.2、1和1.4 mg·mL^(-1)时的回收率均在85%～115%的范围内。对同1批3个待测样品进行测定,rcc-rhC1INH含量为(0.082±0.008)%,RSD为9.8%;ox-rhC1INH含量为(0.35±0.05)%,RSD为14.3%,显示该方法具有较好的专属性、准确性和精密度。4批测试样品中,rcc-rhC1INH的含量分别为0.083%、0.021%、0.033%、0.042%,ox-rhC1INH的含量分别为0.34%、0、0、0。结论:经方法学验证,RP-HPLC方法可用于rhC1INH中rcc-rhC1INH和ox-rhC1INH的含量检测。

人C1酯酶抑制剂活性动态显色检测方法的建立及验证

目的建立人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor or C1 inhibitor,C1-INH)活性的动态显色检测方法,并进行验证。方法采用棋盘法分析C1酯酶与发色底物C1E 5603[CH3OC-Lys(Cbo)-Gly-Arg-pNA·AcOH]反应后的A值变化率(ΔA/min),确定能使不同浓度酶饱和的最低底物浓度。将C1-INH浓缩制剂标准品与C1酯酶孵育,剩余的C1酯酶与底物C1E 5603作用产生A值,将ΔA/min与C1-INH活性进行拟合,绘制标准曲线。验证该方法的线性范围、选择性、特异性、准确度、精密度、稳定性,并进行样品添加试验。将验证后的该方法应用于C1-INH制备工艺过程样品的分析。结果确定C1酯酶的浓度为28μg/mL,底物浓度为2.4 mmol/L,反应结果监测4 min。C1-INH标准品在0.15~0.025 IU/m 范围内与ΔA/min呈良好的线性关系,R2≥0.99,校正标样回算浓度在标示值的90.2%~105.4%内;CM阳离子交换层析洗脱缓冲液、HIC疏水层析平衡缓冲液、人纤溶酶原(plasminogen,Plg)、人纤溶酶(plasmin,Plm)的响应值均低于定量下限响应的7.2%,并低于内标响应的2.7%;20 mmol/L以下的pH 5.0Na Ac及300 mmol/L以下的Na Cl对C1-INH活性检测无影响;检测定量上限、高、中、低、定量下限质控样品,批内准确度在90.0%~114.8%之间,批内CV在0.7%~13.7%之间,批间准确度在94.2%~108.3%之间,批间CV在1.2%~9.7%之间;C1酯酶与底物C1E 5603室温放置3 h不影响检测结果;样品添加试验回收率在94.5%~106.1%之间。CM阳离子交换层析洗脱液、DEAE阴离子交换层析洗脱液、HIC疏水层析流穿液中C1酯酶抑制剂的特异性活性逐渐升高,分别为0.79、1.84、2.61 IU/g。结论本方法具有良好的选择性、准确度、精密度、特异性及稳定性,可作为C1-INH制备工艺中的内部控制指标。

重组人C1酯酶抑制剂中聚合物含量的测定

目的:建立分析重组人C1酯酶抑制剂(rh C1INH)中聚合物含量的分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)方法。方法:rh C1INH稀释后,采用TSK GEL3000SW色谱柱,214 nm检测波长对其聚合物进行检测,以250 mmol·L^(-1)磷酸缓冲液(p H 6.8)为流动相,流速0.5 mL·min^(-1)进行洗脱。结果:在25.0～85.0μg·m L^(-1)浓度范围内,rh C1INH标准品的峰面积与浓度的线性关系良好(R^2平均值为0.997)。rh C1INH样品中分离到3个聚合物峰,采用面积归一法计算6次进样的聚合物的平均含量分别为0.11%、0.15%和0.60%,RSD分别为10.7%、9.0%和3.9%。4批次rh C1INH样品中总聚合物的含量分别为0.82%、1.01%、0.97%和0.92%。结论:SEC-HPLC方法适用于rh C1INH中聚合物的检测,为其聚合物质量标准的建立和产品评价奠定了基础。

人C1酯酶抑制剂的研究进展

C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH),又称C1抑制物(C1 inhibitor),是目前已知的唯一一种既能通过经典途径,又能通过凝集素途径对补体系统进行调节的血浆蛋白酶抑制物,其在补体系统、激肽释放酶-激肽系统、纤溶系统和凝血系统中发挥重要的调节作用。目前有4种C1-INH浓缩制剂批准上市,均用于治疗或预防遗传性血管性水肿(hereditary angioedema,HAE)。本文就C1-INH的生化性质与生理功能、相关疾病与临床研究、C1-INH浓缩制剂的制备工艺及产品比较作一综述。

C1酯酶抑制剂的非蛋白酶抑制功能

C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1INH)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族,能够调节补体系统、激肽释放系统、纤溶系统和凝血系统。目前在临床上主要用于遗传性血管性水肿的治疗。但最近的研究表明C1INH除丝氨酸蛋白酶抑制作用外,还具有多种非蛋白酶抑制功能,如抗炎和抗凋亡作用。而且很多动物实验和临床试验显示C1INH对脓毒症(sepsis)、心肌缺血等疾病也有治疗作用。本文主要综述C1INH的非蛋白酶抑制功能的最新研究进展。

人C1酯酶抑制剂初步纯化过程pH值和聚乙二醇含量的优化

目的探讨pH值、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)含量和离心条件对PEG4000粉末用于去除人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH)制备原料中的IgM效果的影响,并通过对羧甲基(carboxymethyl,CM)离子交换层析中洗脱盐离子浓度的筛选,分离活性与非活性C1-INH。方法向不同pH值的C1-INH制备原料中加入不同质量分数的PEG4000,于不同条件下离心后,用特定蛋白检测仪对离心后上清液中IgM和C1-INH含量进行检测,确定PEG沉淀法纯化C1-INH的最佳条件。将离心后上清液调节pH后作为CM离子交换层析上样样品,使用不同盐离子浓度的洗脱液对活性C1-INH进行分离,确定最佳的盐离子浓度。结果在弱酸性pH(6.8)下,当PEG4000质量分数为12%,离心条件15000×g、25℃、20 min时,IgM去除率>99%,且C1-INH的回收率>80%;在盐离子浓度为200 mmol/L时,产物中C1-INH的比活性最大(4.43 IU/mg),且绝大多数杂质蛋白得以去除。结论优化条件下,PEG4000能有效去除C1-INH制备原料中的IgM,且能保持较高的C1-INH回收率;CM离子交换层析能对活性与非活性C1-INH进行有效分离,并去除大多数杂质蛋白。

活动期类风湿关节炎患者血清基质金属蛋白酶-3及其组织抑制剂-1水平的检测和意义

目的研究活动期类风湿关节炎(rheum atoid arthritis,RA)患者血清基质金属蛋白酶-3(m atrix m etalloproteinase3,M M P-3)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors ofm etalloproteinase1,TIM P-1)的水平及其相关影响因素,探讨M M P-3及TIM P-1在R A的作用机制。方法选择41例初诊活动期RA患者和30名正常健康志愿者,以酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测血清M M P-3及TIM P-1水平,计算M M P-3/TIM P-1,同时测定关节功能、X线、关节肿胀数(SJC)、血沉(ESR)、类风湿因子(R F)、C反应蛋白(CR P)等相关实验室指标。结果活动期R A患者血清M M P-3、TIM P-1明显增高(P<0.01),且以M M P-3增高更为显著,M M P-3/TIM P-1较正常组亦增高(P<0.05)。不同关节功能分级时,上述指标差异无统计学意义(P>0.05),而不同X线分期时,各指标差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。M M P-3、M M P-3/TIM P-1与SJC(P<0.01)、CRP(P<0.01)、ESR(P<0.05)呈正相关,二者与年龄、病程、晨僵时间、RF无明显相关性(P>0.05)。结论M M P-3、TIM P-1在RA血清中高水平存在,二者比例失衡导致RA发生。M M P-3、M M P-3/TIM P-1的高低可作为反映病情活动及预后的指标,阻断M M P-3高水平有可能成为治疗RA的新途径之一。

遗传性血管性水肿C1INH基因I440V变异及其对结构的影响

目的通过基因测序了解遗传性血管性水肿（HAE）患者C1酯酶抑制剂（C1INH）基因第八外显子的变异情况。方法从HAE患者外周血白细胞中提取基因组DNA，PCR扩增第八外显子片段后插入pUC19质粒载体再转化入感受态大肠杆菌TG1菌株，培养扩增质粒DNA，提取纯化后进行基因测序。将患者血清进行SDS～PAGE及Western印迹，以了解该变异对C1INH结构的可能影响。结果在1例Ⅰ型HAE患者的第八外显子中发现一个变异位点，16776A〉G，致440位的异亮氨酸突变成缬氨酸（1440V），SDS—PAGE及Western印迹显示该患者血清中C1INH全部表现为96000片段而非正常的105000片段。结论1440V是一个新的C1INH基因变异，位于C1INH反应中心环的P4位，变异可能导致C1INH分子构象发生改变。

遗传性血管性水肿防治进展

遗传性血管性水肿(HAE)是一种罕见的常染色体显性遗传病,水肿可发生在任何部位,其中最致命的是上呼吸道黏膜水肿,可导致窒息甚至危及生命。传统的抗组胺药物、糖皮质激素和肾上腺素治疗无效。随着对该病发病机制的不断探索,不断涌出现越来越多的可以视为靶向治疗的药物,为HAE的诊断和治疗开辟了新的前景。

遗传性血管性水肿发病机制

遗传性血管性水肿(HAE)是以C1酯酶抑制剂(C1 INH)或FⅫ基因突变为分子遗传学基础、以发作性皮肤和(或)黏膜下水肿为主要表现的一种遗传性疾病。作为一种重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,C1酯酶抑制剂在补体系统、接触系统、纤溶系统、凝血系统等多个系统中发挥着重要作用,当其出现缺陷时会引起缓激肽形成级联反应的过度活化,这是水肿发作病理生理机制中的主要环节,现已有大量实验数据支持这一观点。而对于FⅫ基因突变引发水肿的具体机制尚不清楚。此外还有部分患者并未携带上述2种基因的突变,他们发生水肿的原因还有待进一步的研究。

遗传性血管性水肿的研究进展

遗传性血管性水肿是一种由于C1酯酶抑制剂的合成障碍或功能缺陷所致的常染色体显性遗传病。该病尚无满意治疗,但最近研究发现其发病的主要介质是缓激肽,故激肽释放酶抑制剂和缓激肽2型受体拮抗剂成为新药研发的热点,为治疗提供了更多的选择。对遗传性血管性水肿的病因及发病机制、临床表现及分型、治疗进行概述。