乙肝病毒X基因突变的人肝癌细胞稳转株的构建及其生物学行为变化

目的构建稳定表达乙肝病毒X基因(HBx)突变(C1653T、T1753C)的HepG2、Huh7细胞株,探讨突变点对肝癌细胞生物学行为的影响。方法以含HBx的pLVX-HBx-IRES-tdTomato质粒为模板,点突变合成pLVXHBxC1653T-IRES-tdTomato、pLVX-HBxT1753C-IRES-tdTomato慢病毒质粒。双酶切和Sanger测序的方法鉴定重组质粒的准确性。空白HepG2、Huh7细胞为对照组,pLVX-HBx-IRES-tdTomato、pLVX-HBxC1653T-IRES-tdTomato、pLVX-HBxT1753C-IRES-tdTomato慢病毒液感染HepG2、Huh7细胞,0.6μg/mL嘌呤霉素筛选单克隆细胞进行扩大培养。免疫染色和Western blot法检测X蛋白(HBX)的表达鉴定稳转株的构建;CCK-8法测定细胞的增殖能力;Western blot法检测细胞中EMT相关信号分子的表达情况。两组间进行独立样本t检验。结果双酶切和Sanger测序结果显示重组慢病毒质粒酶切后片段大小正确,点突变位置及碱基替换正确,成功构建pLVX-HBx-IRES-tdTomato、pLVXHBxC1653T-IRES-tdTomato、pLVX-HBxT1753C-IRES-tdTomato慢病毒质粒。免疫染色及Western Blot结果显示转染HBx及突变型的HepG2、Huh7细胞均有HBX表达,空白对照组均无HBX表达,成功获得稳定表达HBx、HBxC1653T和HBxT1753C的HepG2、Huh7细胞稳转株。增殖实验表明HBx及突变型均较对照组明显促进肝癌细胞的增殖(P<0.01),而HBxC1653T突变较HBx进一步促进肝癌细胞的增殖(P<0.05)。同时HBxC1653T突变明显上调N-cadherin的表达、下调E-cadherin的表达,促进了上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)的发生。结论成功获得稳定表达HBx、HBxC1653T和HBxT1753C的人肝癌细胞HepG2、Huh7细胞稳转株;HBxC1653T突变可导致肝癌细胞的增殖能力增强及EMT发生。