C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H2B基因的克隆与同源性分析

目的获取C2株蓝氏贾第鞭毛虫H2B组蛋白基因序列,与WB株蓝氏贾第鞭毛虫及其他物种进行同源分析。方法 PCR扩增获取H2B组蛋白基因,连接pGM-T载体,转化E.coli DH5α感受态宿主细胞,挑选阳性克隆并进行序列分析,与美国WB株蓝氏贾第鞭毛虫及模式生物H2B组蛋白基因和蛋白序列进行同源分析。结果测序C2株蓝氏贾第鞭毛虫H2B组蛋白基因序列,同源比对结果显示其基因序列与美国WB株完全一致,进化树分析表明贾第虫H2B组蛋白基因在进化过程中与其他物种分化较早。结论蓝氏贾第鞭毛虫H2B组蛋白基因同源分析结果显示贾第虫与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远,为进一步研究蓝氏贾第鞭毛虫的生物进化地位提供有价值的资料。

双氢青蒿素对C2株蓝氏贾第鞭毛虫Alpha-7.3giardin基因mRNA表达水平的影响

目的观察双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)Alpha-7.3giardin(α-贾第素)基因mRNA表达水平的影响,探讨其对蓝氏贾第鞭毛虫骨架蛋白的损伤作用。方法用双氢青蒿素浓度为100μg/mL、200μg/mL的改良TYI-S-33培养基分别培养C2株蓝氏贾第鞭毛虫2h、4h、8h、12h后,以不含药物组为对照,实时荧光定量RT-PCR检测药物作用后Alpha-7.3giardin基因mRNA表达水平的变化。结果双氢青蒿素作用虫体后Alpha-7.3giardin基因mRNA表达水平明显低于对照组,二者有显著性差异。结论双氢青蒿素对C2株蓝氏贾第鞭毛虫Alpha-7.3giardin基因mRNA的表达具有明显的抑制作用,抑制效果与药物浓度和作用时间相关,提示双氢青蒿素对蓝氏贾第鞭毛虫骨架蛋白具有损伤作用。

C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H3基因的克隆表达与基因分析(英文)

目的克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,与WB株蓝氏贾第鞭毛虫进行同源分析,构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树。方法 PCR扩增获取H3组蛋白基因,构建pGM-T-H3重组载体,转化E.coli TOP10感受态宿主细胞,挑选阳性克隆并进行序列分析,利用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ构建pET28a(+)-H3重组载体,转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导组蛋白H3表达,Western blotting鉴定表达,与美国WB株蓝氏贾第鞭毛虫及模式生物H3组蛋白基因和蛋白序列进行同源分析。结果成功克隆表达C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白基因,同源比对结果显示C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因序列与美国WB株完全一致,但与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远。结论 C2株蓝氏贾第鞭毛虫H3组蛋白分子进化树分析表明贾第虫H3组蛋白基因在进化过程中与其他物种分化较早,本研究结果为进一步研究蓝氏贾第鞭毛虫的生物进化地位提供有价值的实验资料。

双氢青蒿素对C2株蓝氏贾第鞭毛虫Delta giardin抑制作用的研究

目的建立实时荧光定量RT-PCR(real-time quantitative,RT-PCR)检测C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)Delta giardin基因mRNA表达量的方法,分析双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)对体外C2株蓝氏贾第鞭毛虫Delta giardin基因mRNA表达水平的影响。方法分别采用100μg/mL、200μg/mL的双氢青蒿素改良型TYI-S-33培养基培养C2株蓝氏贾第鞭毛虫,以不含药物组作为阴性对照,分别培养2h、4h、8h、12h,提取总RNA,逆转录合成cDNA,实时荧光定量PCR检测Delta giardin基因mRNA表达情况。结果 100μg/mL双氢青蒿素培养2h、4h、8h、12h后,Delta giardin基因mRNA相对表达量分别为0.44、0.26、0.25、0.02;200μg/mL双氢青蒿素培养2h、4h、8h、12h后,Delta giardin基因mRNA相对表达量分别为0.30,0.26,0.11,0.02。药物对照组中C2株蓝氏贾第鞭毛虫Delta giardin基因mRNA表达量明显低于阴性对照组。结论双氢青蒿素对C2株蓝氏贾第鞭毛虫Delta giardin基因mRNA的表达具有明显的抑制作用,提示双氢青蒿素对蓝氏贾第鞭毛虫具有明显的防治效果。

C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP基因的克隆表达及蛋白结构分析

目的利用大肠杆菌对C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白(Impact-like protein)进行克隆表达,运用生物信息学软件进行蛋白结构分析。方法提取C2株蓝氏贾第鞭毛虫基因组DNA,PCR扩增ILP基因,构建pGM-T重组载体,挑选阳性克隆并进行序列分析;将ILP基因连入原核表达载体pET-28a(+),并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。运用PSIPRED和SWISS-MODEL进行蛋白结构分析。结果成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-ILP,该基因全长831bp。SDS-PAGE结果显示,目的蛋白条带出现在相对分子量约33kD的位置,与预期相符。Western blot结果表明,大肠杆菌成功表达了重组蛋白。结论成功克隆、表达并分析C2株蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白,为蓝氏贾第鞭毛虫ILP蛋白结构与功能的研究提供了有价值的资料。

4种蓝氏贾第鞭毛虫体外诱导成囊方法的比较

评价 4种不同的体外诱导蓝氏贾第鞭毛虫成囊方法。采用 4种已报道的方法对蓝氏贾第鞭毛虫C2株进行体外诱导成囊 ,并统计包囊数目。结果表明 4种方法都可诱导成囊 ,但成囊数之间存在显著差异。方法 3获得的包囊数最高 ,为 1× 10 5/mL。方法 3为体外诱导蓝氏贾第鞭毛虫C2株成囊的一种简便且易获得大量包囊的方法。

体外诱导蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的成囊和脱囊

目的在体外诱导蓝氏贾第鞭毛虫C2株完成其生活周期。方法通过提高改良TY-S-33培养基中的胆汁浓度至10mg/ml、pH至7.8来诱导成囊;体外诱导的包囊先经酸刺激,再用胰蛋白酶处理而诱导其脱囊。结果体外成功诱导了蓝氏贾第鞭毛虫的成囊和脱囊。体外诱导的包囊呈椭圆形,光镜下观察有折光性,经诱导后,部分脱囊或完全脱囊成滋养体,形成的滋养体接近于梨形。结论通过诱导,蓝贾第鞭毛虫C2株可在体外完成其生活史。

C2株蓝氏贾第鞭毛虫组蛋白H4基因的克隆与同源性分析

目的从C2株蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)基因组中获得组蛋白H4基因序列并进行同源比对。方法采用组织/细胞基因组DNA提取试剂盒提取贾第虫的基因组DNA,利用Primer Premier 5软件设计特异性引物,应用PCR技术从贾第虫基因组中获得H4组蛋白基因,构建pGM-T重组载体,转化TOP10感受态细菌,挑选阳性克隆并进行序列分析,分析结果与美国WB株贾第虫及其他模式生物H4组蛋白基因和蛋白序列分别进行同源比对。结果成功克隆并得到C2株贾第虫H4组蛋白基因序列,基因片段大小为310bp,同源比对结果显示其基因序列与美国WB株完全一致,进化树分析表明C2株贾第虫组蛋白H4基因在生物进化上较为独立,与其他物种存在较大分歧。结论C2株贾第虫与其他现存真核生物亲缘关系较为疏远,为进一步研究贾第虫的生物进化地位提供了实验资料。