巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA(命名为HbC2)。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5'-UTR和232bp的3'-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。

水稻OsGAP1 C2结构域中对钙离子的结合能力强于对钾离子

钙离子作为植物细胞的第二信使,广泛参与植物应对不同逆境胁迫的信号调控过程。水稻G蛋白促进蛋白1(Oryza sativa GTPase-activating protein 1,OsGAP1)包含1个C2结构域,而含C2结构域的蛋白质是一类钙离子结合蛋白质,受钙信号的调控。本研究鉴定了水稻OsGAP1的由5个保守性天冬氨酸残基组成的阳离子结合区域。该区域可结合2个钙离子或者钾离子,且其结合钙离子的强度高于其结合钾离子的强度,但是不能结合镁离子。当将其中2个保守的天冬氨酸残基(Asp-23和Asp-28)突变为丙氨酸后,其对钙离子的结合能力减弱。对OsGAP1 C2结构域阳离子结合区域结合金属离子能力的研究,有助于加深对钙信号调控蛋白质的认识,为其在农业生产中的应用提供理论依据。

百脉根不定根发育相关基因LcC2DP1的克隆与功能初步分析

为研究百脉根(Lotus corniculatus L.)C2钙依赖蛋白激酶基因LcC2DP1在不定根形成过程中的功能,通过RACE法从百脉根中克隆LcC2DP1基因,利用qRT-PCR检测其时空表达模式,并通过农杆菌介导的瞬时表达系统在百脉根中过量表达LcC2DP1并鉴定其功能。结果显示:LcC2DP1基因全长705 bp,编码235个氨基酸,分子质量为25.95 ku,与蒺藜苜蓿同源性最高(82%);在百脉根不定根分化过程中持续表达,表达部位为根、茎和叶片;与野生型亲本(WT)相比,转LcC2DP1基因百脉根(TP)的不定根分化提前1~2 d;在不定根分化的9~15 d,其总根长分别是WT的168%、155%,根体积分别是WT的249%、161%,根尖数分别是WT的156%、137%。TP百脉根的总根长(P<0.01)、根体积(P<0.01)和根尖数(P<0.05)表现出一定的发育优势,表明LcC2DP1基因可能与百脉根不定根发育调控相关。

缺氧条件下肺岩宁方抑制TC2N的表达对肺癌细胞培养基诱导的HUVEC细胞增殖、迁移侵袭和管腔形成的影响

目的探讨缺氧条件下肺岩宁方(FYN)对肺癌细胞培养基诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移侵袭和管腔形成的影响。方法使用不同浓度的肺岩宁方(200-6400μg·mL^(-1))处理HUVEC细胞,CCK-8法检测细胞存活率,计算其半数抑制浓度(IC_(50)),确定最佳干预浓度。使用A549细胞培养基在缺氧条件下诱导血管新生模型,将HUVEC细胞分为对照组(Control)、模型组(Model)、800μg·mL^(-1)肺岩宁方组(FYN)、100μg·mL^(-1)贝伐珠单抗组(Bevacizumab,阳性对照)、800μg·mL^(-1)肺岩宁方+慢病毒载体组(FYN+vector)、800μg·mL^(-1)肺岩宁方+TC2N过表达组(FYN+TC2N),每组设置6个复孔。分别检测细胞增殖、迁移与侵袭,管腔生成实验评价血管形成,qRT-qPCR检测HIF-1α、TC2N基因水平,Western blot法检测HIF-1α、TC2N、E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达。结果肺岩宁方对HUVEC细胞的IC_(50)为893.00μg·mL^(-1);与对照组比较,模型组细胞存活率、细胞迁移与侵袭能力、管腔形成节点数、Vimentin、Snail、HIF-1α、TC2N基因及蛋白表达升高,E-cadherin表达降低(P<0.05);与模型组比较,肺岩宁方组与贝伐珠单抗组细胞存活率、细胞迁移与侵袭能力、管腔形成节点数、Vimentin、Snail、HIF-1α、TC2N基因及蛋白表达降低,E-cadherin表达升高(P<0.05);与肺岩宁方+慢病毒载体组比较,肺岩宁方+TC2N过表达组细胞存活率、细胞迁移与侵袭能力、管腔形成节点数、Vimentin、Snail、TC2N基因及蛋白表达升高,E-cadherin表达降低(P<0.05)。结论肺岩宁方可通过抑制TC2N的表达,抑制HUVEC细胞增殖、迁移、侵袭与血管生成。

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以c DNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97%以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因c DNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过Eco RⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体p MAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L-1IPTG诱导1—5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦c DNA全长序列,命名为Ta C2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框(ORF),5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 k D,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域(C2-domain)。多序列比对及进化树分析表明,Ta C2DP1与乌拉尔图小麦Tu C2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示Ta C2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体p MAL-c2X-Ta C2DP1,在IPTG诱导下得到90 k D左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行Ta C2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。Ta C2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,Ta C2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,Ta C2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta C2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,Ta C2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。

下调C2CD3通过抑制Hedgehog通路调控上皮性卵巢癌增殖、侵袭和迁移

目的·研究含C2钙依赖性结构域蛋白3(C2 calcium dependent domain containing protein 3,C2CD3)在卵巢癌组织中的表达与临床病理参数的关系,及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移的影响和可能机制。方法·免疫组织化学方法检测卵巢癌组织及正常卵巢组织中C2CD3的表达水平,分析C2CD3表达水平与卵巢癌临床病理参数的相关性。下调SKOV3细胞中C2CD3基因,EdU检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测C2CD3、Shh、Ptch1、Smo及Gli1蛋白水平。结果·C2CD3表达于卵巢癌细胞质,在卵巢癌组织中C2CD3呈强阳性表达,正常卵巢组织中呈弱阳性表达或不表达。与正常卵巢组织比较,C2CD3在卵巢癌中表达明显增高(P<0.05)。C2CD3表达与肿瘤分期及分级相关,分期越高,表达越强(P<0.05);分级越高,表达越强(P<0.05)。在不同年龄及组织类型中表达差异无统计学意义。下调卵巢癌SKOV3细胞C2CD3基因后,卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移能力均降低(均P<0.05);C2CD3、Shh、Ptch1、Smo及Gli1蛋白水平均下降。结论·C2CD3在卵巢癌组织中表达上升。下调C2CD3基因后,卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭和迁移能力均下降,可能与抑制Hedgehog通路中Shh、Ptch1、Smo及Gli1蛋白相关。

胰岛素对子宫内膜癌细胞Shc/ERK通路活化的影响

背景与目的探讨胰岛素对子宫内膜癌细胞Src同源区2结构域蛋白C（Shc）活化、Shc与生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的结合水平及对细胞外信号调节激酶（ERK）活化程度的影响。方法10-6mol/L胰岛素作用子宫内膜癌Ishikawa3-H^-12细胞不同时间,检测不同时间点细胞Shc磷酸化、Shc·Grb2复合物水平以及ERK的磷酸化程度。结果胰岛素以时间依赖方式活化导子宫内膜癌细胞Shc/ERK通路,Shc在胰岛素作用1min即出现活化增强,15min时达到峰值[p-p52Shc/p52Shc（73.75±2.93vs16.89±1.92）;p-p46Shc/p46Shc（35.65±5.17vs13.71±2.77）]。细胞静息状态下检测不到Shc·Grb2复合物,胰岛素能促进Shc·Grb2结合,与Shc活化时程一致,即1min可检测出Shc·Grb2结合,15min时结合程度最大。胰岛素显著诱导子宫内膜癌细胞ERK活化,具有时间依赖性,作用30min时达到峰值（p-ERK/ERK：63.40±4.52vs22.66±3.76）。结论胰岛素以时间依赖模式促进子宫内膜癌Ishikawa3-H^-12细胞Shc活化、Shc·Grb2结合以及ERK的活化。

SHCBP1在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的研究SHCBP1基因在人肝癌组织中的表达情况,探讨SHCBP1基因在肝细胞癌发生发展中的作用。方法采用半定量RT-PCR、荧光定量PCR(时实PCR)、免疫组织化学法等方法检测SHCBP1基因在52例临床肝细胞癌样本的癌及癌旁组织和人正常组织的表达情况,应用统计学方法分析结果。结果①SHCBP1基因mRNA表达水平在人正常组织中表达具有明显差异;在肝细胞癌样本中明显高于癌旁组织(P<0.05);②免疫组化结果检测显示SHCBP1蛋白在癌旁组织组织中低表达或不表达,而在肝细胞癌组织中表达明显增高,且棕色染色区域主要集中在肿瘤细胞边缘细胞膜位置;③Western blot检测结果显示SHCBP1蛋白在肝细胞癌样本中高表达,癌旁组织中不表达或低表达(P<0.05);④临床统计资料分析显示SHCBP1基因的表达情况与肝细胞癌患者的性别、年龄、临床分期无关,而与肿瘤的直径大小、个数、分化程度、脉管浸润紧密相关。结论 SHCBP1基因在肝细胞癌组织中呈高表达,可能通过影响多种癌症信号通路分子促进肝癌的发生发展,同时该基因可能成为肝癌治疗的潜在新靶点。

JMJD2C和HIF-1α在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的 探讨含十字形结构域蛋白2C （JMJD2C） 和缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系.方法 回顾性分析2005至2007年浙江省人民医院胃肠外科收治的110例胃癌患者的临床资料,其中男78例,女32例,平均年龄57（32～79） 岁,术前未经任何放化疗.通过免疫组织化学法检测110例原发性胃癌组织及80例癌旁正常胃黏膜组织中JMJD2C和HIF-1α蛋白表达情况.结果 JMJD2C约在69.1%（76例）的胃癌组织中呈高表达,正常胃黏膜组织中表达阴性（P〈0.05）;胃癌组HIF-1α的阳性表达率为73.6%（81/110）,而正常胃黏膜组织中无表达（P〈0.05）.胃癌组织中JMJD2C的表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、临床TNM分期和淋巴结转移、远处转移密切均相关（均P〈0.05）,而与患者性别、年龄、肿瘤大小等因素均无关（均P＞0.05）.HIF-1α的表达与胃癌的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移等均有关（均P〈0.05）,而与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度等因素均无关（均P＞0.05）.JMJD2C和HIF-1α表达呈正相关（r=0.219,P〈0.05）.Kaplan-Meier生存分析显示JMJD2C阳性组和HIF-1α阳性组平均生存时间均分别低于其阴性组[（38±4）比（56±6）个月,（38±4）比（60±6）个月,χ2=8.006、7.218,均P〈0.01];JMJD2C和HIF-1α双阳性组平均生存时间显著低于单阳性组和双阴性组（χ2=10.425,P〈0.01）.结论 JMJD2C和HIF-1α在胃癌组织中呈高表达,二者的表达呈正相关;JMJD2C和HIF-1α共同参与胃癌的发生,浸润,转移等生物学行为,可作为评价胃癌恶性程度和预后分析的新指标.