长时间不同频率电刺激对C2C12肌管细胞代谢指标和基因表达的影响

探究长时间不同频率EPS对C2C12肌管细胞代谢指标和基因表达的影响,试图建立EPS诱发C2C12肌管细胞TG堆积和线粒体功能增强的细胞模型。方法:采用4种EPS方案诱发C2C12肌管细胞收缩,实验分为5组:对照组(C组)、30 V+2 ms+0.5 Hz组(0.5 Hz组)、30 V+2 ms+1 Hz组(1 Hz组)、30 V+2 ms+5 Hz组(5 Hz组)、30 V+2 ms+10 Hz组(10 Hz组)。比色法检测细胞内TG、乳酸和ATP含量,RT-PCR方法检测细胞中IL-6、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx、Cyt C和PGC-1α等mRNA含量。结果:1)与C组相比,EPS后即刻,频率0.5~10 Hz组乳酸含量非常显著增加(P<0.01);频率1 Hz和10 Hz组细胞中ATP含量均显著降低(P<0.05),其中频率0.5 Hz和5 Hz组细胞中ATP含量非常显著降低(P<0.01)。2)与C组相比,频率0.5 Hz和1 Hz组MyHCⅠ和MyHCⅡb的mRNA含量显著增加(P<0.05),频率5 Hz组MHC4种亚型mRNA含量变化不明显(P>0.05),频率10 Hz组MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡb亚型mRNA含量非常显著降低(P<0.01),而MyHCⅡx亚型mRNA含量非常显著增加(P<0.01)。3)与C组相比,频率0.5~10 Hz组PGC-1α和Cyt C mRNA含量均显著增加(P<0.05),同时EPS增加了C2C12细胞中IL-6 mRNA的含量(P<0.05)。4)与C组相比,4 d EPS方案停止后12 h,各组肌管细胞中TG含量均没有出现变化;4 d EPS方案停止后24 h,0.5 Hz组和1 Hz组肌管细胞中TG含量增加但无显著性(P>0.05);4 d EPS方案停止后36 h,0.5 Hz组和5 Hz组细胞中TG含量显著增加(P<0.05)。结论:EPS方案(电压14 V、频率1 Hz、单次时长2 ms和每天2 h共2 d,紧接着,电压30 V、频率0.5 Hz或1 Hz或5 Hz、单次时长2 ms和每天3 h共2 d,EPS停止后36 h)能够明显诱发C2C12肌管细胞TG含量堆积和线粒体功能增强。

LPS通过AKT/FOXO1信号通路诱导C2C12肌管细胞MuRF1基因转录

以C2C12肌管细胞为试验材料,探讨脂多糖(LPS)诱导的炎症反应对肌管蛋白降解相关基因及信号通路的影响。选取不同质量浓度(10、100、1 000ng·mL-1)的LPS分别刺激C2C12肌管细胞30min和3h,通过RTqPCR检测炎症因子TNF-α和IL-6的基因转录,确定LPS最佳刺激浓度以建立细胞炎症模型。用最佳浓度LPS分别刺激C2C12肌管细胞0min、30min、1h、3h、6h、12h、24h,RT-qPCR检测MAFbx基因和MuRF基因在不同时间点的转录量变化。此外,1 000ng·mL-1 LPS刺激C2C12肌管细胞12h后,Western blot检测AKT/FOXO1、mTOR和P38信号通路相关蛋白质的表达情况。结果表明:LPS刺激C2C12肌管细胞的最佳浓度为1 000ng·mL-1,在作用30min和3h时均能显著上调TNF-α、IL-6的基因转录,而在刺激12和24h时MuRF1、IL-1β、IL-6和TLR4的基因转录显著上调。此外,1 000ng·mL-1 LPS刺激C2C12肌管细胞12h时,仅AKT和FOXO1蛋白磷酸化水平明显降低。基于以上结果,推测LPS通过调控AKT/FOXO1信号通路诱导C2C12肌管细胞MuRF1转录。

电刺激对C2C12肌管自由基代谢及Nrf2/ARE信号通路的影响

目的:探讨电刺激模拟运动对小鼠骨骼肌肌母细胞(C2C12)肌管自由基及Nrf2信号通路的影响。方法:C2C12细胞分化6天后分为对照组和电刺激组,对照组不进行电刺激,电刺激组采用45V、20ms、5 Hz的刺激强度对C2C12肌管进行电刺激,根据刺激时间为分为30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、120 min和150 min组。测定不同刺激时间C2C12肌管内活性氧自由基(ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及核因子E2相关因子2(Nrf2)核蛋白含量的变化。结果:(1)与对照组相比,C2C12肌管内ROS生成的量除30 min和150 min组外,其余各刺激时间组都明显增加(P<0.05),其中60 min和120min组极显著增加(P<0.01)。(2)与对照组相比,C2C12肌管中GSH-Px活性在60 min、90 min、120 min组有显著性增加(P<0.05),75 min和150 min组时有极显著增加(P<0.01)。(3)与对照组相比,C2C12肌管Nrf2核蛋白表达在60 min、90 min、120 min组有显著性增加(P<0.05),75 min和150 min组时有极显著增加(P<0.01)。结论:在45V、20 ms、5 Hz的强度下,电刺激C2C12肌管会使肌管发生氧化应激,结合ROS产生量随电刺激时间的变化规律,发现ROS只有达到一定的量才能激活Nrf2信号系统,同时启动相关基因,使GSH-Px发挥抗氧化作用,而且随着刺激时间的增加,肌管内抗氧化能力略有降低,随后则继续保持着较高的活性。

电刺激引起C2C12肌管IL-6蛋白及IL-6、GLUT4基因表达的变化

目的:研究骨骼肌细胞在不同时间的电刺激下产生的GLUT4基因与肌源性IL-6蛋白含量及其基因表达之间的关系。方法:以小鼠骨骼肌肌母细胞(C2C12)为研究对象,分为电刺激组和对照组。分别测定当刺激时间为45 min、60 min、75 min、90 min及120 min时C2C12肌管内糖原含量、GLUT4和IL-6 mRNA表达以及C2C12肌管上清液IL-6含量。结果:(1)电刺激各组GLUT4 mRNA表达均有所增加,其中60 min、75 min和120 min组显著高于对照组(P<0.05);电刺激75 min和120 min组IL-6 mRNA表达显著高于对照组(P<0.05);电刺激各组上清液IL-6含量均显著高于对照组(P<0.05)。(2)随电刺激时间增加,上述各项指标均先增加,后下降,90 min时达低谷。(3)随电刺激时间延长,C2C12肌管糖原含量逐渐减少,其中,刺激120分钟组糖原含量与对照组相比显著减少(P<0.05)。结论:(1)电刺激C2C12肌管对细胞糖代谢产生了一定影响;(2)电刺激C2C12肌管引起的GLUT4 mRNA表达的增加很可能与肌管收缩产生的IL-6有关。

谷氨酰胺补充和电刺激对C2C12肌管蛋白合成通路的影响

目的:C2C12肌管为细胞模型,探讨电刺激模拟运动与谷氨酰胺补充对C2C12肌管蛋白质含量及mTOR通路的影响,进一步探明谷氨酰胺补充与蛋白质代谢之间的关系。方法:谷氨酰胺孵育分化5天的肌管48h后,给予一次电刺激(15 V,30ms,3Hz,90min)。分别在电刺激后0h、6h、18 h和24 h收样。实验共10组,单独对照组(Con);单独谷氨酰胺组(Gln);单独电刺激后不同时间点取样组(Es0、Es6、Es18、Es24);谷氨酰胺孵育加电刺激后不同时间点取样组(Gln+Es0、Gln+Es6、Gln+Es18、Gln+Es24)。BCA法测定各组肌管蛋白含量;RT-PCR法测定各组mTOR mRNA表达量及其下游因子S6K1 mRNA表达量。结果:1)与Con相比,Gln组的蛋白含量、mTOR及S6K1 mRNA均显著升高(P<0.05)。2)单独电刺激(Es)后,随收样时间延长,肌管蛋白含量呈现先下降后上升趋势。Es6极显著下降(P<0.01),Es18极显著上升(P<0.01)。而mTOR和S6K1 mRNA的表达没有下降,呈现先上升后恢复正常的趋势。3)谷氨酰胺和电刺激(Gln+Es)联合作用后,无论是蛋白含量,还是mTOR及S6K1 mRNA表达,具有与单独电刺激相似的作用趋势,且Gln+Es各组数值均高于Es各组(P<0.05)。此外,Es组mTOR表达在电刺激后18h达高峰,而Gln+Es组在6h达高峰。结论:1)单独电刺激、单独补充谷氨酰胺、两者的联合作用,均可通过mTOR通路中mTOR mRNA和S6K1 mRNA表达上升,增加蛋白合成,促进蛋白含量上升及肌管恢复。2)谷氨酰胺使电刺激后C2C12肌管mTOR mRNA表达提前,S6K1mRNA表达稳定处于高水平。

黑花生衣色素的提取及调节C2C12肌管细胞葡萄糖消耗的作用研究

从花生加工中的副产物黑花生衣中提取纯化黑花生衣色素(BPSP),并初步探究其相关细胞生物学活性。首先,采用紫外可见(UV-vis)全光谱扫描及分光光度法对BPSP的检测条件、对温度和pH稳定性以及最佳提取条件进行了探究,发现BPSP在pH2~3、520nm可见波长时有最佳特征吸收峰,其在水溶液中比在乙醇溶液中更为稳定,BPSP水溶液在温度不高于50℃、pH为2.0的条件下稳定性最好;此外,BPSP的最佳提取条件为:70℃、pH2.0的酸性水溶液浸提15min,此条件下BPSP的提取率为7.95mg/g干黑花生衣重。进一步采用乙酸乙酯(EtOAc)萃取结合大孔树脂柱层析的方法对BPSP花色苷进行纯化,BPSP总花色苷纯度从粗提液的5.2%提高至25.4%,提高了近5倍。最后,选用纯化后的BPSP干预分化成熟的C2C12肌管细胞,发现5μg/mL剂量的BPSP能够显著增加C2C12肌管细胞对葡萄糖的消耗量(P<0.05),并且在1~5μg/mL的范围内呈现出剂量依赖关系。

不同浓度EPA和DHA对C2C12肌管细胞IL-6表达及TRPV1/PKC/Ca^(2+)信号通路的影响

目的探讨不同浓度二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)对C2C12肌管细胞IL-6表达与分泌的调节作用和机制。方法采用25、50、100、200、400μmol/L EPA或DHA处理C2C12肌管细胞12、24、36 h,设立BSA对照组。MTT检测细胞活性,PCR与Western blot分别检测IL-6的mRNA与蛋白表达水平,ELISA测定IL-6分泌水平,检测TRPV1、PKC的mRNA表达水平及TRPV1、PKC、p-PKC蛋白表达水平,Fluo-4 AM钙离子荧光探针检测胞内Ca^(2+)浓度。结果IL-6表达与分泌方面,100μmol/L EPA或DHA干预24h可显著提高肌管细胞IL-6 mRNA表达;100μmol/LEPA或DHA干预24h、36h可显著促进IL-6分泌;100μmol/L EPA或DHA可呈时间梯度上调IL-6蛋白表达水平。各浓度EPA或DHA干预肌管细胞24h后,IL-6 mRNA表达水平与分泌均呈浓度梯度增加,其中200、400μmol/L效果最为显著;50、100、200μmol/L EPA与25、50、100、200μmol/L DHA干预组IL-6蛋白质表达水平较对照组均显著增加,100μmol/L EPA和DHA增加IL-6蛋白表达最为显著。信号通路方面,100、200、400μmol/L EPA与DHA显著提高肌管细胞TRPV1 mRNA表达水平;200、400μmol/L EPA与100、200、400μmol/L DHA干预组TRPV1蛋白表达水平较对照组显著升高。400μmol/L EPA与DHA可显著上调PKC mRNA表达水平;100、200、400μmol/L EPA干预组p-PKC蛋白表达水平与p-PKC/PKC比值显著增高,而200、400μmol/L DHA可显著增加肌管细胞PKC、p-PKC蛋白表达水平以及p-PKC/PKC比值。各浓度EPA与DHA干预组均显著增加肌管细胞胞内Ca^(2+)含量。结论EPA与DHA在适宜浓度可以促进C2C12肌管细胞IL-6的表达与分泌,EPA和DHA可能通过TRPV1/PKC/Ca^(2+)信号通路刺激肌源性IL-6的表达与分泌。[营养学报,2023,45(2):148-156]

NR4A1对毒胡萝卜素诱导C2C12肌管细胞糖代谢功能障碍的影响

目的探讨NR4A1对毒胡萝卜素(TG)诱导小鼠C2C12肌管细胞糖代谢功能障碍的影响及机制。方法体外诱导C2C12细胞分化为成熟肌管细胞,将加入20 nmol/L胰岛素刺激10 min的细胞标记为胰岛素组,未做特殊处理的细胞标记为对照组,采用Western blotting法检测磷酯酰肌醇⁃3⁃激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路、NR4A1蛋白水平。采用CCK8法检测TG浓度梯度处理的C2C12肌管细胞活力,建立糖代谢损伤细胞模型。将C2C12肌管细胞分为对照组、无水乙醇(EtOH)组、TG组,分别处理后加入胰岛素刺激,采用葡萄糖试剂盒检测葡萄糖消耗水平,采用Western blotting法检测NR4A1、p⁃PI3K、p⁃AKT蛋白表达。采用慢病毒感染并筛选,获得对照与稳定过表达NR4A1的C2C12肌管细胞,并进行TG处理,分为Ad⁃NC组、Ad⁃NC+EtOH组、Ad⁃NC+TG组和Ad⁃NR4A1+TG组。分化成熟后加入胰岛素刺激,检测葡萄糖消耗水平,检测NR4A1、p⁃PI3K、p⁃AKT的表达。结果与对照组相比,胰岛素组C2C12肌管细胞PI3K/AKT通路磷酸化水平及NR4A1表达水平显著升高(P<0.01)。CCK⁃8结果显示,TG浓度大于1μmol/L时,细胞活力显著下降(P<0.01)。与EtOH组相比,TG组葡萄糖消耗减少,NR4A1表达水平下降,PI3K/AKT蛋白磷酸化水平受到抑制(P均<0.01)。胰岛素刺激C2C12肌管细胞,与Ad⁃NC+TG组相比,Ad⁃NR4A1+TG组葡萄糖消耗增加(P<0.05)、PI3K/AKT信号通路显著活化(P<0.05)。结论TG导致C2C12肌管细胞糖代谢功能障碍。NR4A1对TG诱导的C2C12肌管细胞糖代谢障碍具有改善作用,其机制可能通过PI3K/AKT信号途径发挥作用。

2mM肌酸孵育对电刺激C_2C_(12)肌管细胞糖原合成通路的影响

目的:研究肌酸对骨骼肌糖原合成调节的影响及机制;方法:用培养的C2C12为细胞模型,用电刺激模拟神经冲动引起其收缩,测定肌酸孵育后电刺激下C2C12肌管细胞的糖原含量以及AMPKα1、HKII及GS-I等糖原合成通路中相关基因表达;结果:肌酸孵育能够有效促进电刺激下C2C12肌管糖原的合成,主要机制是糖原合成通路激活后,AMPKα1激活对糖原合成的正效应。但2mM肌酸孵育可能触发负反馈调节机制,抑制电刺激下C2C12肌管糖原合成相关酶基因的表达,维持细胞的内稳态;结论:细胞实验提示在体的肌酸补充能够促进骨骼肌糖原合成,增加肌糖原贮备,提高运动能力,为肌酸的合理补充提供参考依据。

瘦素通过PI3K-PKB-m TOR信号通路调节C2C12肌管蛋白质代谢

试验旨在探讨瘦素是否通过PI3K-PKB-mTOR信号通路调节骨骼肌细胞蛋白质的代谢。试验以C2C12肌管为研究对象,于无血清DMEM高糖培养基中添加0、100 nmol/L Wortmannin(PI3K活性的抑制剂)或0、20 nmol/L Rapamycin(mTOR活性的抑制剂)预处理45 min后,在培养基中添加0 ng/mL或50 ng/mL重组小鼠瘦素处理2 h,进而测定C2C12肌管内PKB磷酸化水平、mTOR磷酸化水平和蛋白质代谢。结果表明:重组小鼠瘦素处理显著提高了C2C12肌管PKB磷酸化水平、mTOR磷酸化水平和蛋白质合成(P<0.05),显著降低了C2C12肌管蛋白质分解(P<0.05);而Wortmannin或Rapamycin的预处理显著抑制了重组小鼠瘦素对C2C12肌管PKB磷酸化水平或mTOR磷酸化水平的提高,并显著抑制了重组小鼠瘦素对C2C12肌管蛋白质代谢的改善。综上所述,瘦素调节C2C12肌管蛋白质代谢的过程中需要激活PI3K-PKB-mTOR信号通路。

MicroRNA-125b介导棕榈酸诱导的C2C12肌管细胞胰岛素抵抗

目的:探讨microRNA-125b(miR125-b)在棕榈酸诱导C2C12肌管细胞胰岛素抵抗中的作用与机制。方法:C2C12成肌细胞常规方法分化为C2C12肌管细胞;棕榈酸诱导C2C12肌管细胞胰岛素抵抗;定量RT-PCR检测mRNA表达;免疫印迹检测蛋白表达。结果:①棕榈酸诱导C2C12肌管细胞胰岛素抵抗,伴有mTOR信号通路的激活;②抑制mTOR信号通路可显著降低棕榈酸对C2C12肌管细胞胰岛素抵抗的影响;③棕榈酸可显著增加miR-125b的表达,mTOR抑制剂可显著降低棕榈酸对miR-125b表达的影响;④miR-125b模拟剂可诱导C2C12肌管细胞胰岛素抵抗,而miRNA-125b抑制剂可显著减轻棕榈酸诱导的C2C12肌管细胞胰岛素抵抗。结论:棕榈酸经mTOR/miR-125b信号通路诱导C2C12肌管细胞胰岛素抵抗。

白藜芦醇等功能性化合物对C2C12肌管线粒体功能的影响

为发展体外模型作为细胞和分子抗疲劳研究的工具,本研究利用C2C12肌管体外评价功能性化合物(支链氨基酸和酚类化合物)的抗疲劳作用。结果显示,某些功能性化合物(包括白藜芦醇,表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素)能显著提高线粒体基因(细胞色素b,细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ)的表达、线粒体酶活性(包括柠檬酸合成酶)和细胞色素c氧化酶在C2C12肌管中的表达。本研究结果表明白藜芦醇、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素作为新的线粒体激活剂具有很大的潜力,可能在抗疲劳方面发挥重要作用。

佛波酯诱导C2C12肌管自噬及corylifol A的保护作用研究

目的:探索佛波酯(PMA)诱导C2C12肌管自噬的作用机制并考察补骨脂成分次苷酸查尔酮(CYA)对肌管的保护作用。方法:构建能够准确分析细胞自噬状态的mRFP-GFP-LC3B双荧光C2C12成肌细胞,将已分化C2C12细胞分为对照组、PMA组(1μmol/L)、自噬阳性对照组(饥饿组)、CYA组(10μmol/L)及PMA+CYA组。处理时间为48 h。Cytation 5测定细胞在不同波长下的荧光强度,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1及微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)的表达水平,qPCR技术检测蛋白激酶C(PKC)-ε、PKC-β,PKC-θ和缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)的表达水平。用海马能量代谢分析仪(Seahorse XFe 24分析仪)检测细胞线粒体呼吸能力。结果:(1)与对照组比较,PMA(1μmol/L)可使C2C12肌管的黄色荧光斑点显著增加,红色荧光信号强度也显著增强(P<0.01),即自噬及自噬溶酶体均增加。而CYA(10μmol/L)可以显著降低PMA诱导的C2C12肌管黄色荧光斑点和红色荧光信号强度(P<0.01)。(2)与对照组比较,PMA可以上调Beclin-1和LC3BⅡ蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01);与PMA组比较,PMA+CYA组可以降低自噬相关蛋白Beclin-1及LC3BⅡ的蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。(3)与对照组比较,PMA显著降低C2C12肌管的基础呼吸、最大呼吸和ATP的生成(P<0.01)。(4)与对照组比较,PMA组可以显著上调PKC-ε、PKC-β、PKC-θ和HIF-2α基因表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:PMA可能通过激活C2C12肌管的PKC通路来抑制细胞线粒体呼吸,促进HIF-2α的表达,HIF-2α上调自噬相关蛋白Beclin-1和LC3BⅡ的表达,从而诱导C2C12肌管自噬。CYA则可能通过下调Beclin-1和LC3BⅡ的蛋白表达来保护肌管对抗PMA诱导的自噬。

糖负荷对小鼠小肠网膜素基因表达的影响及网膜素对C2C12细胞胰岛素增敏的机制

目的:观察口服葡萄糖负荷对小鼠小肠组织网膜素基因表达的影响及网膜素对C2C12肌管细胞胰岛素敏感性的影响,并进一步探讨其机制。方法:半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测小鼠小肠组织网膜素mRNA的表达;葡萄糖转运实验观察网膜素对C2C12肌管细胞胰岛素敏感性的影响;Western blot检测Akt(Ser473)的磷酸化水平。结果:口服葡萄糖负荷30min后小鼠小肠组织网膜素基因表达显著减低(P<0.05),而60min后恢复至负荷前水平;葡萄糖转运实验发现:网膜素作用10min对C2C12肌管细胞基础葡萄糖转运无影响,但显著增加了胰岛素刺激的葡萄糖转运(P<0.05);Western Blot发现:网膜素和AICAR均显著增加了C2C12肌管细胞Ak(tSer473)的磷酸化水平(P<0.05)。结论:网膜素作为一种胃肠激素还受到葡萄糖负荷的调节,在C2C12肌管细胞,网膜素可通过增加Akt的磷酸化发挥胰岛素增敏作用。

收缩引起骨骼肌细胞活性氧、IL-6含量及其基因表达的变化

目的:利用培养的C2C12作为细胞模型,研究骨骼肌在电刺激强度相同,时间不同的情况下产生的活性氧与肌源性IL-6含量及其基因表达之间的关系。方法:以小鼠骨骼肌肌母细胞(C2C12)为研究对象,分为电刺激组和对照组。测定不同刺激时间C2C12肌管内活性氧(ROS)、IL-6mRNA表达以及C2C12肌管上清液中IL-6的含量。结果:1)电刺激各组的ROS、IL-6含量均显著高于对照组(P<0.05),峰值分别出现在刺激75min和120min;2)IL-6mRNA表达仅在刺激75min和120min时明显增加(P<0.05);3)各指标随电刺激时间的增加都有先增加,然后下降,至刺激90min时达低谷的变化规律,且ROS、IL-6含量在刺激90min时虽明显高于对照组(P<0.05),却明显低于其他各刺激组(P<0.05)。结论:1)C2C12肌管在电刺激下产生的IL-6浓度变化及IL-6mRNA表达均呈"双峰曲线",说明电刺激引起肌管IL-6蛋白变化可能与其基因转录的变化有关;2)电刺激引起C2C12肌管产生的活性氧与肌管IL-6蛋白含量和基因表达的变化规律一致,说明电刺激骨骼肌细胞收缩引起的活性氧的产生可能是肌源性IL-6产生和释放的调节因素之一。