共轭亚油酸对C2C12肌细胞生脂和生肌分化的影响

本研究分析了共轭亚油酸(CLA)对C2C12肌细胞生脂转分化和生肌分化的影响。分别培养并诱导C2C12鼠源肌细胞生脂转分化和正常的生肌分化,同时分别使用终浓度为50μmol/L的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA处理细胞,并设对照组,取生脂转分化第10天和生肌分化第8天的细胞用于实时定量PCR检测,观察c9,t11-CLA和t10,c12-CLA对C2C12肌细胞不同分化的影响。结果表明:1)与对照组相比,c9,t11-CLA促进了C2C12肌细胞的生脂转分化,显著增加了细胞内甘油三酯(TG)含量(P<0.05),显著上调了细胞内脂肪酸合成酶(FAS)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)基因的表达水平(P<0.05);与对照组相比,t10,c12-CLA则抑制了C2C12肌细胞的生脂转分化,显著减少了细胞内TG含量(P<0.05),显著下调了细胞内C/EBPα、PPARγ和FA BP4基因的表达水平(P<0.05)。免疫印迹杂交结果显示FAS和FABP4的蛋白质表达水平也发生了与基因表达相一致的变化。2)与对照组相比,t10,c12-CLA抑制了C2C12肌细胞的生肌分化,显著减少了细胞内肌管数/细胞数(P<0.05),显著下调了细胞内肌细胞生成素(MYOG)和成肌分化抗原(MYOD)基因的表达水平(P<0.05);与对照组相比,c9,t11-CLA则显著上调了细胞内MYOG基因的表达水平(P<0.05),对C2C12肌细胞的生肌分化有一定程度的促进作用。免疫印迹杂交结果显示MYOG和MYOD的蛋白质表达水平也发生了与基因表达相一致的变化。以上结果表明,CLA对动物骨骼肌细胞的正常生肌分化和生脂转分化都具有重要的调节作用。

滇结香花提取物组分1(Fr.1)对C2C12肌细胞胰岛素抵抗的改善作用

探讨滇结香花正己烷提取物组分1(Fr.1)改善棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导C2C12肌细胞产生胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)的效果及其作用机制。方法:本文采用PA诱导C2C12肌细胞建立稳定的胰岛素抵抗细胞模型,通过检测Fr.1对胰岛素抵抗细胞(C2C12/IR)葡萄糖消耗量、葡萄糖摄取量的变化,研究其对PA介导的AMP活化蛋白激酶(AMPK)、胞内磷脂酰肌醇激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路中相关基因及蛋白表达的影响。结果:0.75 mmol/L PA作用C2C12肌细胞16 h作为最佳建模条件;Fr.1在无细胞毒性范围内(12.5~100μg/mL)可显著增加C2C12/IR对葡萄糖的消耗量及摄取量;Fr.1可明显上调胰岛素受体(Insulin receptors,IRs)、胰岛素受体底物(Insulin receptor substrate-1,IRS-1)、葡萄糖转运蛋白4(Glut4)、PI3K、AMPKα基因的表达水平,并上调p-IRs、p-IRS-1、Glut4、p-AMPKα、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC)、p-AKT蛋白质的表达水平,表明滇结香花提取物Fr.1可通过调控多个信号通路改善IR。

叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

小麦肽对小鼠成肌细胞C2C12凋亡的影响及机制研究

目的:采用小鼠成肌细胞C2C12探究小麦肽对其增殖和凋亡的影响,并探明可能的作用机制。方法:CCK-8法检测小麦肽组C2C12和对照组C2C12的增殖和凋亡指数,采用高通量转录组测序进行差异表达分析,通过STRING分析构建差异基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络,经Cytoscape可视化,探究C2C12中受小麦肽影响的潜在靶标基因及其功能。结果:5mg/mL小麦肽组抑制细胞凋亡较对照组差异显著(T>1.67,P<0.05)。相较对照组,小麦肽组C2C12中鉴定出370个差异基因,上调基因表达109个、下调基因表达261个,FC≥3/2or≤2/3。经分析,上调基因表达主要富集于炎症响应、免疫响应、TNF信号通路和IL-17信号通路等相关通路,下调基因表达主要富集于氧化还原过程等相关通路,PPI互作参数interactionscore≥0.7。从PPI的差异基因中得到前10个hub基因,并筛选到趋化因子CXCL1、CCL5、CCL2、CXCL5、CXCR4、Il6、MMP3。经分析,hub基因倾向于在趋化因子介导的信号通路、细胞对趋化因子的反应和趋化因子的反应作为生物学过程方面富集,其中趋化因子CXCL1、CCL2、CCL5基因与C2C12相关。结论:本研究揭示小麦肽可促进C2C12增殖,抑制细胞凋亡。并且小麦肽通过调节CXCL1、CCL5、CCL2、CXCL5、CXCR4等趋化因子表达,抑制成肌细胞的凋亡。

SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应

背景:钟基因Rev-erbα参与调节炎症,但激活Rev-erbα会增加心脑血管疾病风险。为降低相关风险,探索Rev-erbα激动剂SR9009联合其他药物来减轻骨骼肌成肌细胞炎症,奠定治疗炎症相关性骨骼肌萎缩的理论基础。目的:探讨脂多糖刺激C2C12成肌细胞时吲哚丙酸、SR9009与核因子κB信号通路的关系。方法:①1μg/mL脂多糖刺激C2C12成肌细胞,RNA转录组测序结合KEGG通路富集分析信号通路。②CCK-8法检测C2C12成肌细胞活性,筛选吲哚丙酸的最佳给药浓度;然后将细胞分为空白对照组、脂多糖(1μg/mL)组、SR9009(10μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸(80μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸+SR9009+脂多糖组,ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6水平,RT-qPCR检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达,Western blot检测NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达。③siRNA敲减Rev-erbα,RT-qPCR评估敲减效率,检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达。结果与结论:①与空白对照组比较,脂多糖时间依赖性抑制成肌细胞融合形成肌管,白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达水平升高,细胞上清液中白细胞介素6水平显著升高;KEGG通路分析支持脂多糖刺激激活核因子κB信号通路。②吲哚丙酸浓度>80μmol/L时抑制C2C12成肌细胞活性;吲哚丙酸和SR9009通过抑制核因子κB信号通路发挥抗炎作用,降低白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达水平,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值低于脂多糖组。SR9009联合吲哚丙酸显著降低脂多糖诱导的炎症,Toll样受体4、CD14、白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达水平进一步下调,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值显著低于吲哚丙酸+脂多糖组和SR9009+脂多糖组。③Rev-erbα随脂多糖刺激时间依赖性升高;siRNA敲减Rev-erbα效率达58%以上,成功敲减Rev-erbα后添加脂多糖,白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达较脂多糖组显著上调。④结果说明,Rev-erbα可以作为调节炎症反应的靶点,SR9009靶向激活Rev-erbα联合吲哚丙酸能抑制核因子κB信号通路显著减轻C2C12成肌细胞的炎症反应,联合抗炎效果优于单独干预。

Brd2通过Wnt/β-catenin信号通路调控小鼠C2C12成肌细胞的分化

目的 探究溴结构域蛋白2(bromodomain containing 2,Brd2)对小鼠C2C12成肌细胞分化能力的影响及作用机制。方法 通过GEO数据库分析Brd2在肌营养不良患者和健康人骨骼肌组织中的表达水平。用含2%马血清的分化培养基体外诱导C2C12成肌细胞分化,利用Western blot检测分化过程中Brd2的表达。利用慢病毒介导的过表达和RNA干扰技术在C2C12成肌细胞中分别过表达和敲低Brd2,诱导后用细胞免疫荧光实验检测肌管形成情况,通过Western blot检测分化标志物蛋白表达水平的变化。通过转录组测序及相关实验探究Brd2在上述过程中发挥调控作用的分子机制。结果 Brd2在肌营养不良患者的骨骼肌中低表达;体外诱导C2C12成肌细胞分化,第2天时Brd2表达升高,第8天时表达降低;敲低Brd2可以抑制成肌细胞的分化,过表达Brd2则可以促进成肌细胞分化;Wnt/β-catenin信号通路的活性受到Brd2的调控。结论 Brd2通过Wnt/β-catenin信号通路调控成肌细胞的分化,初步提示Brd2可能有利于骨骼肌的再生。

基于C2C12细胞的2,7-二溴咔唑肌发育毒性效应

肌肉有执行机体运动和能量代谢的重要作用。据报道二噁英暴露可严重影响肌肉发育。但目前与多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans,PCDFs)结构相似的卤代咔唑(polyhalogenated carbazoles,PHCZs)的肌肉发育毒性尚不明确。本研究旨在探究2,7-二溴咔唑(2,7-dibromo-9H-carbazole,27-BCZ)的肌肉发育毒性效应。应用C2C12细胞成肌分化模型,在细胞水平上通过苏木素-伊红染色法检测融合指数和单条肌管内细胞核数2个指标评价细胞形态的变化,在分子水平上通过qRT-PCR来测定肌细胞分化调节分子和分化标志物的基因表达,探究27-BCZ对肌发育的影响及其分子机制。细胞水平实验结果显示,与对照组相比,27-BCZ 10^(-7) mol·L^(-1)暴露3 d后,肌管数量减少、形态变细变短,且分布杂乱;单条肌管内细胞核数减少、参与肌管融合的细胞核比例(融合指数)降低;27-BCZ 10^(-9)~10^(-7) mol·L^(-1)暴露6 d后,虽然单条肌管内细胞核数没有显著变化,但融合指数显著降低。分子水平实验结果显示,27-BCZ 10^(-7) mol·L^(-1)在分化末期对肌纤维结构蛋白肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的2个编码基因Myh3和Myh4的表达具有显著抑制作用。另外,27-BCZ还影响肌生成调节因子家族(myogenic regulatory factors,MRFs)基因的表达,包括显著抑制分化早期调节因子MyoD和末期调节因子Mrf4的mRNA表达,显著促进Myogenin mRNA表达。此外,27-BCZ暴露能显著促进芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)信号通路下游基因cyp1a1和cyp1b1的mRNA表达,提示27-BCZ在肌分化模型中具有类二噁英活性。总结上述结果,我们发现,在肌生成过程中,27-BCZ表现出与二噁英类似的AhR活性和肌发育干扰效应,为27-BCZ肌肉发育相关健康效应和AhR相关毒理机制研究提供了基础数据。

芪骨胶囊含药血清对地塞米松诱导C2C12细胞萎缩的保护作用

目的观察芪骨胶囊含药血清对地塞米松诱导的C2C12肌管细胞萎缩的保护作用。方法制备芪骨胶囊含药血清;体外培养C2C12细胞,分为正常对照组、地塞米松组、10%空白血清组、10%芪骨胶囊含药血清组,给予相应药物处理48 h后,除正常对照组外再给予10μmol/L地塞米松继续培养24 h,CCK-8法检测各组细胞活力。用2%马血清诱导C2C12细胞分化6~7 d,按上述分组干预肌管细胞,测量各组肌管细胞直径,Western blot法检测MyHC、MuRF-1、Atrogin-1及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达。加入PI3K抑制剂LY294002,测量肌管细胞直径,检测MuRF-1、Atorgin-1、PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达。结果与正常对照组比较,地塞米松组及空白血清组C2C12细胞活力降低(P<0.01),肌管细胞直径减少(P<0.01),MuRF-1、Atrogin-1蛋白表达升高(P<0.01),MyHC蛋白表达及PI3K、Akt、mTOR、FoxO3a磷酸化水平降低(P<0.01);与地塞米松组比较,芪骨胶囊含药血清组细胞活力升高(P<0.01),肌管细胞直径增加(P<0.01),MuRF-1、Atrogin-1蛋白表达降低(P<0.01),MyHC蛋白表达及PI3K、Akt、mTOR、FoxO3a的磷酸化水平升高(P<0.05,P<0.01)。芪骨胶囊含药血清联合LY294002干预后,芪骨胶囊含药血清的抗肌管萎缩效应消失(P<0.01),MuRF-1、Atorgin-1蛋白表达升高(P<0.01),而PI3K、Akt、mTOR、FoxO3a磷酸化水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论芪骨胶囊含药血清能减轻地塞米松诱导的C2C12肌管细胞萎缩,其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路相关。

“神舟10号”空间飞行对骨骼肌C2C12成肌细胞可塑性的影响

目的研究空间飞行对骨骼肌C2C12成肌细胞增殖和分化可塑性的影响。方法利用"神舟10号"飞船(Shenzhou-10,SZ-10)舱内环境,开展空间细胞学实验,并在地面同步模拟空间舱环境进行实验。进行天基与地基实验细胞的同步活细胞影像监测和细胞固定,天基实验细胞返回后与地基细胞同步开展细胞影像与免疫细胞化学的对比分析。结果 1)活细胞影像监测提示,与地基培养细胞相比,天基细胞培养48 h单核细胞(增殖)减少,且96 h仅见地基培养细胞中出现多核肌管(分化)。2)免疫细胞化学分析表明,地基细胞48 h增殖标志蛋白Myo D表达显著增加,96 h有所下降,而天基培养细胞Myo D表达均显著减少;3)地基实验中48 h细胞开始融合分化,中间结蛋白Desmin阳性单核细胞数目明显增加,但在分化96 h后,Desmin阳性单核细胞数目减少,而3个核以上的肌管明显粗大且数目较多;而天基细胞48 h虽有Desmin阳性单核细胞,但比地基阳性细胞数目明显较少,分化96 h后肌管融合率(约30%)比地基96 h(约78%)显著减少。结论空间飞行期间骨骼肌成肌细胞增殖分化的可塑性显著降低,这可能参与了空间飞行中失重性肌萎缩的形成。

周期性机械拉伸对C2C12成肌细胞增殖的影响

目的:探讨不同的周期性拉伸应变条件对C2C12成肌细胞增殖的影响。方法:周期性拉伸的各种力学条件通过BioFlex加载系统实现,采用应用流式细胞术和BrdU法对拉伸应变下的细胞增殖动力学变化进行分析,反映成肌细胞增殖情况。结果:不同的周期性机械拉伸条件影响C2C12细胞的增殖,拉伸的频率对C2C12细胞增殖有较大的影响。在0.5Hz拉伸频率下,2.5%、5%和10%的细胞变形幅度都不能促进细胞的增殖,其中10%(0.5Hz)的拉伸幅度抑制C2C12成肌细胞的增殖;而在0.125Hz拉伸频率下,10%的细胞变形幅度明显地促进C2C12成肌细胞的增殖。结论:较低的拉伸频率有利于成肌细胞的增殖,高频率的拉伸抑制成肌细胞的增殖。

ShRNA介导的Smad4基因沉默对C2C12成肌细胞纤维化的影响

目的:研究慢病毒介导的Smad4-shRNA对TGF-β1诱导的纤维化进程的影响。方法:(1)设计并选择抑制效能最高的Smad4-shRNA,包装生产慢病毒,转染C2C12成肌细胞,并检测转染后细胞的Smad4表达;(2)根据TGF-β1诱导C2C12成肌细胞向成肌纤维细胞分化的模型,以慢病毒介导的Smad4-shRNA转染细胞,将不同处理的细胞分为A、B、C、D四组,分别为C2C12细胞组、TGF-β1诱导组、C2C12细胞转染组和TGF-β1诱导后转染组。通过荧光Realtime-PCR和Westerblot检测各组collagen I和α-SMA表达水平。结果:(1)慢病毒介导Smad4-shRNA1转染C2C12细胞后,其Smad4 mRNA和蛋白表达显著低于未转染组(P<0.05);(2)TGF-β1诱导组α-SMA和Collagen I mRNA及蛋白表达均显著高于C2C12细胞组(P<0.05);(3)TGF-β1诱导后转染组α-SMA与collagen I mRNA及蛋白表达显著低于TGF-β1诱导组(P<0.05),与C2C12细胞组和C2C12细胞转染组相比则无明显差异(P>0.05)。结论:降低Smad4表达能有效抑制成肌细胞及受TGF-β1诱导成肌纤维细胞的纤维化过程,提示Smad4可能成为拮抗骨骼肌纤维化的靶点。

干扰E2F7对C2C12成肌细胞增殖的影响

【目的】探究转录因子E2F7在骨骼肌细胞发育过程中的作用。【方法】以C2C12成肌细胞为研究对象,通过设计小干扰RNA干扰C2C12成肌细胞中E2F7的表达,分为干扰组和对照组,并利用RT-PCR、CCK-8和EdU等技术检测在C2C12成肌细胞中干扰E2F7后对成肌细胞增殖的影响。【结果】E2F7 mRNA表达水平在C2C12成肌细胞增殖期极显著高于分化期(P<0.01);与对照组相比,干扰组的细胞活率和新生细胞比率皆极显著高于对照组(P<0.01);干扰E2F7显著提升了C2C12成肌细胞中Cyclin E的表达水平(P<0.05),极显著促进Cyclin D和CDK4的表达(P<0.01);并且干扰E2F7可显著促进E2F2 (P<0.05)和极显著促进E2F1及E2F3的表达(P<0.01),同时极显著促进与成肌细胞增殖相关microRNAs (miR-7、miR-25、miR-27和miR-92a)的表达(P<0.01)。【结论】干扰E2F7可促进C2C12成肌细胞的增殖,E2F7可能是通过调控经典E2Fs信号通路和成肌细胞增殖相关microRNA发挥作用。

Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖与分化作用的初步研究

目的初步探讨Reversine对小鼠C2C12成肌细胞增殖分化的影响。方法体外培养C2C12成肌细胞系.实验第一步分三组:A组:正常对照组,B组:1μM Reversine处理12h组,C组:1μM Reversine处理24h组。上述三组用Annexin-V/PI双染法处理C2C12成肌细胞并用流式细胞仪技术检测三组C2C12细胞凋亡的影响;实验第二步分五组:D组:正常对照组,E组:单独1μM Reversine处理7d,F组:单独成骨诱导7d,G组:1μM Reversine诱导12h+单独成骨诱导7d,H组:1μM Reversine诱导12h+1μM Reversine联合成骨诱导7d。上述五组光镜下观察细胞形态的变化,并通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测五组C2C12成肌细胞分化抑制因子(ID2),肌肉发生调节因子(Myogenin),生肌因子后结蛋白(Desmin)mRNA的表达。结果与A组相比,C组1μM Reversine处理24h能引起C2C12细胞明显的凋亡,B组1μM Reversine处理12h的C2C12细胞未见明显的凋亡。与D组相比,E组和H组的细胞增殖明显受到抑制,F组和G组细胞逐渐增殖并融合。结论 Reversine能够显著的抑制成肌细胞的增殖分化过程。

周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的影响

背景:在力学刺激下,肌肉组织发生改建,其中的成肌过程是一个多阶段的发育过程,细胞外基质的许多信号参与了成肌过程,其中力学信号是肌肉形成和再生的重要外界因子。目前国内外有许多关于周期性张应力刺激成肌细胞凋亡和增殖的报道,但是力学刺激在成肌作用中的具体机制目前还明确。目的:探讨周期性张应力对C2C12成肌细胞增殖的作用及影响机制。方法:采用FX4000T应力加载系统对体外培养的C2C12成肌细胞施加10%的周期性张应力,分别作用6,12,24 h。结果与结论:MTT结果显示,随着加力时间的延长C2C12成肌细胞的增殖情况及S期的细胞周期率逐渐增加,在应力作用12 h时增殖效果最明显(P<0.05),随后开始降低。Western blot检测显示,C2C12成肌细胞中核转录因子κB蛋白的表达随加力时间增加而不断减少,加力24 h时表达量又开始上升。结果提示,周期性张应力可以诱导C2C12成肌细胞增殖,能够改变其细胞周期,核转录因子κB可能也参与了此调节过程。

力学信号的拮抗剂或激动剂对体外培养的C2C12成肌细胞自身抗原相关因子表达的影响

目的探讨力学信号的拮抗剂或激动剂对体外培养的C2C12成肌细胞自身抗原表达的影响。方法根据不同的处理方法将C2C12细胞分成对照组、EGTA、A23187、钙调蛋白抑制剂calmidazolium chloride、钙调蛋白(calmodulin)、一氧化氮合成酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、硝普钠(SNP)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-2抑制剂1、重组肝细胞生长因子(HGF)、抗HGF抗体、肝细胞生长因子受体C-met和抗C-met处理组。用Western blot法检测不同处理条件下NuRD脱乙酰酶复合物可重构成分(Mi-2)、组氨酰-tRNA合成酶(HRS)、DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)和Ku-70蛋白的表达变化。结果与对照组相比,A23187、calmodulin组、SNP、重组HGF组、重组C-met处理后,自身抗原表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),EGTA、calmidazolium chloride、L-NAME、抗HGF兔多克隆抗体、抗C-met兔多克隆抗体处理后,自身抗原蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。MMP-2组的自身抗原蛋白水平表达与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论细胞外钙离子和钙调蛋白、L-NAME和SNP、HGF、C-met参与介导成肌细胞自身抗原的表达。

MyHC基因在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达

以体外培养的C2C12成肌细胞为研究对象,然后利用荧光定量PCR检测肌球蛋白重链(myosin heavy chains,MyHC)的3种亚型MyHC1、MyHC2x和MyHC2b在成肌诱导分化中(0-8 d)中的时序表达规律.结果表明,MyHC1基因在诱导分化的0-4 d表达呈上升趋势,4-8 d又呈下降趋势,在第4 d和第6 d的表达水平显著高于其他天数(p<0.05).MyHC2x基因在诱导分化的0-6 d表达呈上升趋势,但在第8 d又开始下降.MyHC2b在诱导分化的0-8 d中表达一直呈上升趋势,第6 d和第8 d表达水平显著高于其他天数(p<0.05).

PGC-1α对C2C12成肌细胞增殖的影响

PGC-1α(Peroxisome Proliferators Activated Receptor gamma coactivator 1 alpha)是一种核受体转录辅助激活因子,广泛参与机体的生物氧化和能量代谢活动.本实验以小鼠C2C12成肌细胞为材料,通过转染pc DNA3.1-flag-PGC-1α真核表达载体,并且与转染空载体的实验对照组比较,利用荧光定量PCR检测转染效果,利用MTT比色法检测PGC-1α对成肌细胞增殖的影响;结果显示,PGC-1α在C2C12成肌细胞中被成功超表达,在转染后的2-5 d,转染真核表达载体组与转染空载体组相比,显著抑制细胞增殖(P<0.05),但在第6 d差异不显著.

C2C12成肌细胞诱导肌性分化过程中miR-101a的表达

以C2C12成肌细胞为模型,在分化培养基中诱导C2C12建立体外肌性细胞分化模型。以poly(A)3'-端加尾和实时定量PCR方法研究miR-101a在C2C12细胞分化过程中的表达情况。结果发现,在细胞转入分化培养基进行肌性分化的1-5 d中,miR-101a的表达量逐渐增加,提示miR-101a可能在肌肉发生中发挥调控作用。

激活Shh信号通路促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化

近年来骨组织工程技术迅猛发展,小鼠成肌细胞C2C12因其来源广泛等优点可望成为有效的种子细胞应用于组织工程.然而,对于C2C12细胞的成骨分化机制仍需深入研究.为了观察Sonic hedgehog(Shh)信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的C2C12细胞成骨分化的影响,构建过表达腺病毒Ad-Shh,并作用于BMP9处理的C2C12细胞,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,RT-PCR检测Shh、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runx2、Dlx5、Id1和Id2基因表达,Western印迹检测Shh、OPN、OCN、Runx2和Dlx5的蛋白质表达,Micro-CT和H&E染色检测裸鼠皮下异位成骨包块情况.结果表明,活化Shh信号通路可促进BMP9诱导的C2C12细胞早晚期成骨分化,以及裸鼠皮下异位成骨.体内外实验证明,Shh信号通路能促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化.

miR-143-3p促进C2C12成肌细胞分化

MicroRNAs(miRNAs)是一类小非编码RNA,近年研究发现其在骨骼肌发育调控中发挥重要作用.为探明miR-143-3p在C2C12成肌细胞分化中的调控作用,采用real-time PCR检测了miR-143-3p在小鼠各组织及C2C12成肌细胞分化过程中的表达;使用miR-143-3p的模拟物和特异性抑制剂分别处理细胞,采用real-time PCR和Western印迹分别检测成肌因子MyoG和成肌标志基因MyHC mRNA和蛋白水平的变化;用免疫荧光染色的方法观察肌管的形成.结果显示,miR-143-3p在小鼠各组织中均有表达,并且随着细胞分化表达量逐渐增加;C2C12成肌细胞过表达miR-143-3p,与对照组相比,成肌调控因子MyoG和成肌标志基因MyHC的mRNA和蛋白表达均显著升高,肌管数量明显增多;抑制剂处理结果显示,细胞分化被显著抑制.检测miR-143-3p对MyHC各亚型表达的影响发现,miR-143-3p表达的变化并不直接影响MyHC各亚型的表达.以上结果说明,miR-143-3p在骨骼肌和成肌细胞中均有表达,能够促进C2C12成肌细胞分化,但并不直接调控MyHCs的表达.