慢性重型肝炎血浆对C3A细胞解毒功能及细胞膜完整性的影响

目的检测C3A细胞在正常人和在慢性重型肝炎血浆中解毒功能及膜的完整性,探讨慢性重型肝炎患者血浆在体外对C3A细胞株功能的影响。方法把C3A细胞分为两组,一组用慢性重型肝炎患者血浆(100%CSHP)培养,另一组用正常人血浆(100%NHP)培养。分别于第24h及第48h,检测培养细胞上清液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天冬氨酸氨基转移酶(AST)含量,于第48h检测C3A细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量。结果在100%CSHP中和100%NHP培养第24h及第48h,培养细胞上清液中ALT和AST含量,100%CSHP组与对照组间差异有非常显著性意义(P<0·01),且第48h与第24h含量间差异有显著性意义(P<0·05)。分别检测在100%CSHP中和100%NHP培养第48h的C3A细胞内GSH含量,100%CSHP组与对照组间差异有显著性意义(P<0·01)。结论慢性重型肝炎患者血浆使C3A细胞内GSH消耗明显增加,导致其解毒功能下降;CSHP使C3A细胞膜受损,并随时间延长而逐渐加重。

体外灌流慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞的细胞色素P4503A活性和表达的影响

目的:通过比较未经灌流处理的重肝血浆及处理过的重肝血浆对CYP3A的影响,阐明C3A细胞安定代谢变化的原因,为未来C3A细胞的改造与功能优化奠定基础。方法:制备血浆和培养C3A细胞;实验分为4组:正常胎牛血浆(NFBP)组,正常人血浆(NHP)组,体外灌流慢性重型肝炎患者血浆(HPP)组,体外未灌流慢性重型肝炎患者血浆(CSHP)组。用分光光度法测定红霉素N-脱甲基酶(ERD)活性即CYP4503A的活性,Western blot法测定CYP4503A4的表达。结果:CSHP组ERD活性低于NFBP组(P<0.05)及NHP组(P<0.05),HPP组ERD活性也低于NFBP组(P<0.05)及NHP组(P<0.05),HPP组ERD活性高于CSHP组(P<0.05);CSHP组CYP4503A4的表达低于NFBP组(P<0.05)及NHP组(P<0.05),HPP组CYP4503A4的表达也低于NFBP组(P<0.05)及NHP组(P<0.05),HPP组CYP4503A4的表达高于CSHP组(P<0.05)。结论:经慢性重型肝炎患者血浆培养的C3A细胞,CYP4503A活性及蛋白表达降低。与之相比,经过体外灌流的慢性重型肝炎患者血浆其C3A细胞CYP4503A活性及蛋白表达有所增加,CYP4503A活性增加可能是导致安定代谢变化的原因。

慢性重型肝炎及肝衰竭患者血浆对C3A细胞活力和蛋白合成功能的影响

目的观察慢性重型肝炎及肝衰竭患者血浆对C3A细胞株的影响,为研究应用C3A细胞株的生物反应器进行生物人工肝支持治疗提供实验依据。方法用100%正常人血浆(normalhumanplasma,NHP)和100%慢性重型肝炎患者的血浆(chronicseverehepatitisplasma,CSHP)培养C3A细胞,四甲基偶氮唑盐法(Methylthiazolyltetrazolium,MTT)检测细胞活力,通过3H-亮氨酸掺入法检测细胞蛋白合成速率,Western-blot分析比较白蛋白合成功能,从细胞活力和蛋白合成方面研究慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞的影响。结果①连续5天检测100%CSHP培养的C3A细胞活力均明显高于100%NHP组,(t值分别为6.26、4.89、3.55、3.94、6.17,P值均小于0.01);②第48h100%CSHP培养的C3A细胞蛋白合成速率高于100%NHP组,结果差异有显著性(t=5.93,P<0.01);③培养24h后Western-Blot分析可见100%CSHP组白蛋白表达量明显高于100%NHP组。结论CSHP对C3A细胞的增殖和蛋白合成功能有促进作用。

体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞CYP450 mRNA表达的影响

目的:通过比较未经灌流处理和体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞CYP4503A表达的影响,为改善C3A细胞的功能活性以提高其治疗效果提供依据。方法:分别用正常人血浆、慢性重型肝炎患者血浆、体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆培养C3A细胞,RT-PCR法测定上述血浆培养的C3A细胞CYP4503A4 mRNA表达,凝胶成像系统获取CYP4503A4/β-action相对值,进行统计学分析。结果:未经灌流处理和体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆培养的C3A细胞CYP3A4 mRNA表达均低于正常人血浆培养组(P<0.05),而体外灌流处理的血浆培养的C3A细胞CYP3A4 mRNA表达高于未经灌流处理的血浆培养组(P<0.05)。结论:在进行生物人工肝治疗之前,配合血液灌流技术对患者血浆进行适当的处理,从而改善生物反应器中细胞的功能活性,将可能提高生物人工肝的治疗效果。

C3A细胞与L-02永生化肝细胞低温保存条件下的生物学特性比较

背景:获得大量功能良好的肝细胞是生物人工肝的核心。探索出一种可靠的肝细胞低温保存方法进而构建一个肝细胞库是目前生物人工肝研究的热点。目的:比较用UW液在4℃条件下保存已经进入Ⅲ期临床试验的C3A细胞与国内构建的永生化肝细胞株L-02细胞的生物学特性。方法:贴壁培养C3A与L-02细胞,胰酶消化,制备成细胞悬液,UW液保存。4℃低温保存0,24,48及72h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率与凋亡率,测定谷草转氨酶与乳酸脱氢酶释放、尿素合成功能及白蛋白分泌功能。结果与结论:随低温保存时间延长,C3A与L-02细胞存活率呈下降的趋势,但C3A细胞的存活率明显高于L-02细胞(P<0.01);细胞凋亡率呈上升趋势,但48h后C3A细胞同L-02细胞无差异(P>0.05)。谷草转氨酶及乳酸脱氢酶释放呈现上升的趋势,但C3A细胞明显低于L-02细胞(P<0.01)。白蛋白分泌功能呈下降的趋势,但C3A细胞明显优于L-02细胞(P<0.01)。尿素合成功能呈下降的趋势,但是L-02细胞明显优于C3A细胞(P<0.01)。结果提示,UW液4℃保存C3A细胞与L-02细胞时间不易超过48h。以C3A细胞为材料的人工肝可能更适用于肝功能衰竭合并低白蛋白血症,以L-02细胞为材料的人工肝更适用于肝功能衰竭合并肝性脑病。

酒精培养C3A细胞NOTCH信号通路的表达

目的观察Notch信号通路在酒精性肝病体外模型中的表达情况及其对C3A细胞增殖的影响。方法将人CYP2E1目的基因转染到C3A细胞系,筛选出稳定表达CYP2E1的肝细胞系为实验组。同时用空质粒转染C3A细胞系为对照组。两组细胞培养基中均加入等浓度酒精、等体积灭菌水和Notch抑制剂进行培养,采用MTT法检测细胞存活率,采用Western-blot法检测Notch下游蛋白Notch受体胞内区域(NICD1)和Hairy/Enhancer ofSplit蛋白(HES1)的表达,采用RT-PCR法检测Notch1mRNA水平。结果酒精使两组细胞存活率下降,Notch抑制剂提高了实验组细胞的存活率;实验组细胞NICD1和HES1表达高于对照组,加入Notch抑制剂后两者表达明显下降;实验组细胞Notch1mRNA水平高于对照组。结论酒精可以激活C3A细胞的Notch信号通路,Notch信号通路阻断剂可使酒精处理的肝细胞存活率升高。

慢性重型肝炎肝衰竭患者血浆对C3A细胞增殖和生物转化功能的影响

急性肝衰竭患者血浆对生物反应器中肝细胞的影响研究较多，并证实患者血浆对所接触的细胞有明显毒性作用。C3A细胞株与正常肝细胞功能接近，易于培养，并已成功应用于临床。现采用C3A细胞为对象，研究慢性重型肝炎肝衰竭患者血浆在体外对其影响。

肝衰竭患者体外灌流血浆对C3A细胞生物转化功能影响的研究

C3A细胞是培养于体外人工肝支持装置（ELAD）系统的细胞株，来源于人肝肿瘤细胞，是克隆化的建株细胞株，其最大特点是来源稳定，能在短时间内大量培养增殖，因此可以满足生物型人工肝装置对肝细胞数量上的需求；此外，该细胞在培养中不需要培养载体，并具有一些肝细胞的特异功能。外源化学物的生物转化作用在肝脏的诸多功能中尤为重要，

N-乙酰半胱氨酸对C3A永生化肝细胞增殖和生物转化功能的影响

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对慢性重型肝炎肝衰竭时肝细胞增殖和生物转化功能的影响,并比较NAC和还原型谷胱甘肽(GSH)的疗效。方法体外慢性重型肝炎患者血浆培养C3A细胞,同时分别加入大、中、小三种剂量NAC及对应剂量的GSH,以正常血浆及培养基(10%FBS-MEM)为对照,分别于24 h、48 h、72 h三个时间点检测细胞安定代谢量的变化,并用MTT法测定C3A细胞活力。结果慢性重型肝炎血浆使细胞的安定代谢量降低,细胞增殖活力提高。NAC和GSH均可提高慢性重型肝炎血浆培养C3A细胞的安定代谢量,呈一定剂量依赖性,并可使细胞增殖活力进一步提高。结论NAC可以显著改善慢性重型肝炎肝衰竭时肝细胞增殖活力和生物转化功能,GSH也有相似功效,相同剂量的NAC优于GSH。

N-乙酰半胱氨酸对C3A永生化肝细胞解毒代谢功能的影响

目的:研究N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对慢性重型肝炎肝衰竭时肝细胞解毒代谢功能的影响,并比较NAC与还原型谷胱甘肽(GSH)的疗效.方法:体外慢性重型肝炎患者血浆(chronic severe hepatitis plasma,CSHP)培养C3A细胞,并同时分别加入大、中、小三个剂量NAC及对应剂量的GSH,以正常血浆(normal human plasma,NHP)及培养基(100 mL/L FBS-MEM)为对照,分别于24、48、72h3个时间点检测细胞内GSH及脂质过氧化物(MDA)的含量,并检测安定代谢量的变化.结果:24、48、72h3个时间点,培养基组、正常血浆组、各剂量NAC治疗组和GSH治疗组C3A细胞中GSH含量与安定代谢量均分别高于慢性重型肝炎血浆组(GSH:F=246.116,235.489,201.536,均P<0.01;安定代谢量:F=306.812,476.722,502.061,均P<0.01),而慢性重型肝炎血浆组C3A细胞中MDA含量均分别高于上述各组(F=332.48,662.349,492.983,均P<0.01).慢性重型肝炎血浆+NAC组与慢性重型肝炎血浆+GSH组比较,前者细胞内的GSH含量和对安定的代谢量,大、中、小剂量组均分别高于后者对应剂量组(P<0.01),而前者细胞内的MDA含量,大、中、小剂量组均分别低于后者对应剂量组(P<0.01).结论:NAC可以显著改善慢性重型肝炎肝衰竭时肝细胞解毒代谢功能,GSH也有相似功效,且相同摩尔剂量的NAC效果要优于GSH.

C3A细胞系构建生物人工肝治疗猪急性肝衰竭研究

目的探讨应用C3A细胞系所构建的生物人工肝对猪急性肝衰竭动物模型的治疗效果。方法将12只中华实验猪颈外静脉注射D-氨基半乳糖以建立急性肝衰竭模型,随机分成对照组(n=6)与生物人工肝治疗组(n=6)。应用C3A细胞系构建体外生物人工肝支持系统,在给予D-氨基半乳糖24h后对治疗组进行连续36h治疗,监测治疗前后不同时间点两组动物的一般状况、生存时间和生化指标。结果对照组动物平均存活时间为(48.9±11.2)h,治疗组存活时间为(105.7±12.6)h,生物人工肝治疗组在给药后48h、72h、96h、120h等各个时间点动物生存率均大于对照组。生物人工肝治疗结束时,血清胆红素、转氨酶下降,白蛋白、凝血酶原活动度上升,与对照组比较,差异有显著性(P<0.05～P<0.01);血氨下降差异不明显(P>0.05)。结论D-氨基半乳糖猪急性肝衰竭模型能够较好的模拟临床急性肝衰竭过程,C3A细胞系生物人工肝具有一定的肝脏合成和解毒功能。

慢性重型肝炎患者血浆体外灌流对C3A细胞增殖功能的影响

重型肝炎是临床最严重的肝病类型之一，预后极差，在内科治疗基础上联合人工肝治疗效果显著。血液灌流是非生物型人工肝的一种，设备中灌流器是关键部件。灌流器中的血液灌流吸附剂种类主要有活性炭和合成树脂，其表面布满吸附位点，灌流时清除与之有高亲和性的各种物质。血浆灌流可以清除体内堆积的毒性物质，稳定机体内环境，阻断恶性循环，使肝细胞得以自发修复、再生，具有重要的临床价值。细胞增殖数量对生物人工肝治疗效果有着重要意义，但血浆灌流对生物反应器中的细胞增殖有何影响研究不多。本研究观察了体外灌流对慢性重型肝炎患者血浆C3A细胞增殖功能的影响，并初步探讨其影响机制。

OSKM诱导过表达c-Jun肝癌细胞重编程

目的构建OSKM诱导的过表达c-Jun肝癌细胞(C3A-c-Jun)重编程细胞系,探讨外源性c-Jun对肝癌细胞重编程的影响。方法通过C3A细胞稳定过表达c-Jun后进行OSKM诱导重编程,通过碱性磷酸酶染色,Real-time PCR,免疫印迹法,免疫荧光等技术对细胞进行鉴定,建立C3A-c-Jun诱导肿瘤干细胞系C3A-c-Jun-i CSCs。结果 C3A-c-Jun-i CSCs克隆呈圆顶状,边缘圆钝,克隆内细胞小且排列紧密,多层分布,碱性磷酸酶染色阳性,mRNA和蛋白水平均可表达多潜能性标记物OCT4、SOX2;C3A-c-Jun-i CSCs组外源性和内源性Sox2的表达量均明显高于C3A-i CSCs对照组;在重编程过程中c-Jun持续表达。结论 OSKM诱导C3A、C3A-c-Jun肝癌细胞重编程,分别建立C3A-i CSCs和C3A-c-Jun-i CSCs细胞系,发现外源性c-Jun通过上调Sox2基因的表达,启动下游一系列反应,对肝癌细胞重编程过程起促进作用。

一种适合肝细胞生长的无血清培养基

背景：寻找一种既能适合细胞生长又避免添加血清的培养基迫在眉睫,无血清培养应运而生.目的：探索一种适用于C3A 细胞生长的无血清培养基,为肝细胞用于临床治疗以及生物人工肝走入临床奠定基础.方法：分别用无血清培养基、完全培养基和基础培养基培养C3A 细胞,观察细胞的生长状态,绘制细胞生长曲线和活力曲线,全自动生化分析仪测定上清中谷丙转氨酶漏出量、尿素含量,放射免疫分析法检测白蛋白分泌量,实时荧光定量PCR检测基因水平的变化情况.结果与结论：3 种培养基培养的细胞生长良好,无血清培养基组与完全培养基组细胞密度在培养周期内,除第7 天以外差异无显著性意义（P 〉 0.05）.培养第4~7 天,其他两组明显高于基础培养基组（P 〈 0.05）;无血清培养基尿素合成水平〉完全培养基〉基础培养基（P 〈 0.05）.Real-time qPCR 显示,无血清培养基组相对于完全培养基组仅CK18、CK19 和HNF4α基因表达量下降（P 〈 0.05）.说明实验研制了一种适合于肝细胞（C3A）生长的无血清培养基,与传统血清培养能达到同样的效果.

人肝肿瘤细胞系生物人工肝治疗重型肝炎的临床初步研究

目的观察人肝肿瘤细胞系生物人工肝治疗重型肝炎病人的临床疗效和安全性。方法对5例重型肝炎病人先行持续的血浆透析滤过和血浆置换,次日进行持续72h的人肝肿瘤细胞系生物人工肝支持治疗,观察患者转归。结果治疗后患者总胆红素由212.0±74.8μmol/L降至145.3±88.7μmol/L(P<0.05),8周后降至23.4±6.0μmol/L(P<0.01);血清AFP从158.4±99.7ng/ml升高至903.7±66.3ng/m(lP<0.05),但在8周后明显下降到95.1±58ng/ml;凝血酶原活动度在治疗中一度下降,但治疗2周后明显恢复。最终3例病人临床痊愈出院,1例好转,1例死亡。结论人肝肿瘤细胞系生物人工肝支持系统可用于重型肝炎患者的治疗,并无严重的副反应发生。

生物人工肝细胞材料的研究进展

近年来,许多学者对生物人工肝(bioartificial liver,BAL)多种来源的细胞材料进行了广泛深入地研究和探索,但生物人工肝细胞材料的来源问题至今仍未得到满意解决。本文对近年来生物人工肝细胞材料研究进展进行综述,以期为建立和选择理想的生物人工肝细胞材料的深入研究提供参考。

生物人工肝的细胞来源及其研究进展

肝衰竭的病死率极高,生物人工肝(BAL)是治疗肝衰竭的重要措施。目前,肝细胞作为BAL的主要生物成分,其来源一直是BAL系统研究的重点及难点之一,现就BAL系统应用的肝细胞来源作一综述。

还原型谷胱甘肽对肝细胞解毒代谢功能影响的体外实验研究

目的:在细胞水平上研究还原型谷胱甘肽(GSH)对慢性重型肝炎肝衰竭时肝细胞解毒代谢功能的影响。方法体外培养C3A细胞,在培养基加入慢性重型肝炎患者血浆(CSHP),并同时分别加入大中小三个剂量的GSH(25mmol/l,5mmol/l,1mmol/l),以正常血浆(NHP)及培养基为对照,分别于24小时、48小时、72小时3个时间点检测细胞内GSH及脂质过氧化物(MDA)含量的变化。结果①慢重肝血浆使细胞内GSH含量下降、MDA含量增加。②GSH可以提高慢重肝血浆细胞内GSH含量,补充内源性GSH的损耗,降低细胞内MDA含量。③随剂量的增加,上述作用更为明显。结论GSH可以改善慢性重型肝炎肝衰竭时肝细胞解毒代谢功能,且存在量效关系。

C3A永生化肝细胞系的部分功能评价

全面检测肝永生化细胞系的功能,对评价其功能状态、比较不同肝细胞系的差别、研究生物人工肝的疗效、判断药物对肝细胞功能的影响,以及改建与优化更好的肝细胞系等方面具有重要的意义。C3A细胞是目前用于临床研究的生物人工肝永生化肝细胞系,它从肝纤维母细胞瘤细胞转化获得。本研究以C3A细胞为对象,对反映肝细胞生长增殖、蛋白合成、代谢、分泌、抗氧化的部分指标进行检测,以期建立较全面反映其功能状态的检测方法，为其细胞改建与功能优化提供依据，为新一代生物反应器及生物人工肝发展服务。