高粱C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的分子克隆及其转基因水稻的培育

应用PCR的方法从C4植物高粱的基因组中分离出C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ppc基因)。通过分步克隆的方法,将此基因插入pCAMBIA1301质粒载体上,构成重组的表达载体p1301-PEPC,并利用农杆菌介导的转化系统将其转入农垦58和中花10两个粳稻品种。经PCR分析、PEPCase活性检测、Western杂交、Northern杂交和Southern杂交等多种方法鉴定表明,C4型Ppc基因已转化进受体水稻植株的核基因组,并能高水平表达。生理学检测显示,转基因水稻植株的CO_2朴偿点和光呼吸速率显著降低,光饱和光合速率和羧化效率提高,显示出C4植物的光合特征。

籽粒苋C_4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是C4途径的关键酶之一。本研究克隆了双子叶植物籽粒苋(A.hypochondriacus L.)C4型PEPC基因的cDNA和gDNA全长序列。该基因编码区cDNA全长2895bp(GenBank登录号为HQ186302),编码964个氨基酸残基。对应的gDNA全长为6785bp,含10个外显子和9个内含子,内含子总长3890bp,其中第一内含子最长,为1662bp,具GATA-motif、G-box等15个光应答元件,9个激素应答元件,29个CAAT box,72个TATA box。该特征在本研究范围内的植物中,为籽粒苋所独有。比较多种植物表明,不同植物之间的C3/C4型PEPC基因的外显子长度具有较高的一致性,而内含子的长度变化较大。不同植物PEPC基因对核苷酸具有一定的选择性,并且外显子和内含子的GC含量呈正相关。总的趋势是单子叶植物外显子和内含子的GC含量均高于双子叶植物。利用半定量RT-PCR分析表达模式,发现籽粒苋PEPC基因主要在叶片中表达,表达量随光照时间延长而增加。

甘蔗C_4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因植物表达载体构建

根据用于转化的甘蔗 C4Ppc基因的特点 ,分别构建了无启动子、35 S启动子、2 x35 S启动子的植物表达载体 p BIpepc、p L Apepc、p CBIpepc;用盐冻融法将其导入农杆菌 LBA4 40 4 ,可用于烟草、水稻、大豆、甘薯等 C3 作物遗传转化。

甘蔗C_4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因转化烟草研究初报

将全长6.8 kb含所有内含子及部分5’侧端和3’末端的甘蔗C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因插入植物目的基因载体pBI121,经农杆菌介导转化获得转基因烟草,PCR检测和dot southern分析证实外源基因已整合进入烟草基因组中。甘蔗C4Ppc基因导入烟草后其叶片PEPC活性有所提高,但提高较小。因此,有必要继续进行克隆目的基因的5’侧端和3’末端获得其完整序列后用于C3作物的遗传转化研究。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子结构研究进展

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)广泛存在于高等植物、藻类及大多数细菌中,催化C4光合作用固定CO2的第一步反应。在过去的10年中关于PEPC分子的一级结构研究已取得显著的进展,最近,通过X-射线衍射分析阐明了大肠杆菌和玉米C4型PEPC分子的三维结构,就这些研究进展进行总结。

干旱胁迫下调节ATP的含量对提高转玉米C_4型pepc水稻光合速率的影响

为了分析三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）是否是限制高表达转玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（C4-pepc）水稻光合速率提高的限制因素,本文以高表达的转玉米 C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因水稻（PC）及其原种‘Kitaake’（WT）作为试验材料,喷施蒸馏水（对照）、2 mmol·L^-1亚硫酸氢钠溶液、100μmol·L^-1 N′-（3,4-二氯苯基）-N,N-二甲基脲[3-（3′,4′-dichlorophenyl）-1,1-dimethylμrea, DCMU]和10μmol·L-1寡霉素（oligomycin）溶液过夜处理5~6叶期水稻幼苗,在20%（m/v）PEG-6000模拟干旱胁迫条件下,研究不同处理对水稻叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间二氧化碳浓度（Ci）、ATP含量、玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性以及光系统Ⅱ（photosynthemⅡ, PSⅡ）实际光化学效率（actual photochemical efficiency of PSⅡin the light，ΦPSⅡ）的影响。试验结果表明,喷施亚硫酸氢钠溶液提高了PC和WT在水培条件下叶片的Pn, DCMU和寡霉素溶液处理则降低了PC和WT叶片的Pn。喷施亚硫酸氢钠溶液增加了WT叶片Gs和Ci,但降低了PC叶片Gs和Ci。喷施DCMU溶液增加了PC和WT叶片Ci,但降低了叶片Gs。用20%PEG-6000模拟干旱胁迫处理后,亚硫酸氢钠、DCMU和寡霉素溶液处理的水稻叶片 Pn均下降,喷施亚硫酸氢钠溶液处理可以减缓Pn下降的趋势,喷施DCMU和寡霉素溶液加速了叶片Pn的下降。在20%PEG-6000处理8 h后, PC在喷施不同试剂处理下Gs差异不大,但其Pn变化显著。进一步的研究表明不同处理下叶片中ATP含量、PEPC活性以及ΦPSⅡ出现显著变化, DCMU处理引起ATP含量、PEPC活性和ΦPSⅡ快速下降,亚硫酸氢钠溶液处理能够减缓这些参数的下降,喷施寡霉素降低了叶片中的 ATP含量,但是对ΦPSⅡ没有显著影响。因此认为,在干旱胁迫条件下, PEPC的高表达能够维持较高的PSⅡ活性,与原种相比，也产生较高含量的ATP,来维持净光合速率的稳定。

海藻糖对转C_(4)型PEPC水稻种子萌发耐旱性的影响

为揭示海藻糖参与高表达转玉米C_(4)型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(C_(4)-PEPC)水稻(Oryza sativa)(简称PC)在干旱胁迫下种子萌发的生理机制,本研究以PC及其未转基因野生型受体Kitaake(简称WT)种子为材料,研究外施不同浓度海藻糖联合干旱处理下,其种子活力、萌发过程中可溶性糖和脯氨酸含量、α-淀粉酶活性,以及α-淀粉酶、PEPC、糖信号、部分海藻糖相关基因的表达。结果表明,干旱处理均显著抑制了两材料的发芽率,并且抑制了芽的生长;外施低浓度海藻糖可缓解干旱对种子萌发的抑制,与WT相比,PC对海藻糖更加敏感,当海藻糖浓度为0.5 mmol·L^(-1)时已表现出明显的缓解效应,且较10 mmol·L^(-1)海藻糖对WT的缓解效果更佳。外施0.5 mmol·L^(-1)海藻糖联合干旱处理可以维持水稻的种子活力、种子内渗透调节物质含量以及α-淀粉酶活性,尤其有益于PC。外施0.5 mmol·L^(-1)海藻糖通过上调PC内依赖钙信号的CBL1-OsSnRK3.1/3.23基因的表达,激活OsK1a-OsMYBS1/2-OsAmy3/8途径;同时诱导OsTPP1/7合成海藻糖,上调蔗糖和葡萄糖含量,进而增强糖代谢,维持种子萌发。此外,海藻糖也上调了SAPK8/9/10和C_(4)-PEPC的转录水平,使PC在芽期表现耐旱。本研究结果为改善直播稻田的发芽率和"C_(4)稻"的创制提供了新线索。

转C_4光合基因水稻特征特性及其在两系杂交稻育种中的应用

对pepc、ppdk和pepc +ppdk三种转基因水稻农艺性状观察表明 ,与原种Kitaake相比单株有效穗有不同程度的增多 ,单株产量相应提高 ,特别是pepc和ppdk基因聚合后 ,单株有效穗和单株产量分别比受体亲本Kitaake提高 2 9.1%和2 7.0 %。三种转基因材料作基因供体分别与受体光敏核不育系培矮 6 4S、2 30 4S和 2 30 6S杂交后 ,这些基因在新的遗传背景下不仅稳定遗传和高水平表达 ,而且表现增穗增产 ,特别当pepc和ppdk基因聚合时 ,与受体相比 ,F1的PEPC活性提高 5 .8～ 18.6倍 ,PPDK活性提高 0 .5～ 1.3倍 ,植株饱和光合速率提高 5 0 %左右。转育的转基因材料结实率有所降低 ,是值得进一步研究的问题。

干旱条件下DCMU对高表达转C4-pepc水稻的花青素合成基因及其相关信号的影响

为了揭示高表达转玉米C4-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,EC 4.1.1.31)基因水稻(PC)在耐旱中光合与花青素调节途径的内在联系,本研究以PC和未转基因野生型原种(WT)的水培苗为试验材料,在4~5叶期,通过50μmol·L-1光合抑制剂DCMU[3-(3’,4’-dich-lorophenyl)-1,1-dimethyl-urea]预处理1 h,观察其在12%PEG-6000模拟干旱处理下的表现。结果表明,在模拟干旱条件下,DCMU预处理使两种供试材料相对含水量显著下降,且PC相对含量显著高于WT;干旱处理下,两种材料的花青素含量显著升高,DCMU和干旱处理使两种材料的花青素含量下调,且PC水稻中始终伴随着较高的花青素含量。光合数据表明,与单独12%PEG-6000处理相比,DCMU联合12%PEG-6000处理显著抑制了两种水稻材料的净光合速率、气孔导度、胞间CO2含量及羧化效率,但PC的各指标显著高于WT。同时,DCMU联合12%PEG-6000处理显著下调两种供试材料的内源蔗糖含量,但PC中蔗糖含量显著高于WT。进一步研究发现PC中更高的蔗糖含量与花青素合成有关转录因子b HLH(Os B1,Os B2)、R2R3-MYB(Os C1)、COP1(constitutively photomorphogenic 1)、HY5(elongated hypocotyl 5)更高的转录水平同步,下游花青素合成相关基因Os PAL、Os CHI、Os CHS、Os F3H、Os F3’H、Os DFR、Os ANS的表达量增加。PC水稻可能通过诱导NO和Ca2(10)感受干旱信号,参与转录因子的调节,进而参与花青素合成基因的调控,合成较多的花青素,增强PC水稻对干旱逆境的响应,增强保水能力,最终表现耐旱。

转玉米PEPC基因水稻中有限的C4光合微循环及其生理作用

用转PEPC基因水稻(Oryza．sativa L．subsp．japonica，Kitaake)和原种水稻Kitaake为材料，研究了不同基因型水稻叶片中的C4光合微循环及其功能。通过测定与光合C4途径有关的关键酶，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、NADP^+-苹果酸酶(NADP^+-ME)、NADP^+-苹果酸脱氢酶(NADP^+-MDH)和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)，说明原种水稻叶片中具有完整的C4光合酶体系；用外源OAA或MA饲喂叶切片或叶绿体后明显增加光合速率，证明原种水稻中具有一个有限的光合C4微循环。将玉米自PEPC基因导入原种水稻后，可大幅度提高光合C4微循环的速率。测定不同基因型的CO2交换速率，看出水稻中C4光合微循环的增强有提高净光合速率(Pn)和降低光呼吸速率／净光合速率(Pr/Pn)比值的作用。叶绿素荧光特性分析表明，C4光合微循环的增强伴随着PSⅡ电子传递效率(Fv／Fm)和光化学猝灭(qP)的增加以及非光化学猝灭(qN)的降低；这些结果为通过基因工程手段提高作物光合效率的遗传育种提供了科学根据。

C_4植物的相关问题

1 C4植物维管束鞘细胞的叶绿体既然没有基粒,为什么还显现绿色,能否进行光反应? 现行高中生物选修教材是这样描述的:C4植物中构成维管束鞘的细胞比较大,里面含有没有基粒的叶绿体,这种叶绿体不仅数量比较多,而且个体比较大,叶肉细胞则含有正常的叶绿体.据此推测:在C4植物维管束鞘细胞中的叶绿体由于没有基粒,不能进行光反应,只能进行暗反应.据研究发现,C4植物维管束鞘细胞叶绿体中的内膜系统主要由基质片层(基质类囊体)组成.以上资料为C4植物维管束鞘细胞中有叶绿素提供了证据.因此准确的表述应该是在维管束鞘中含有较大的叶绿体,有基质类囊体但是没有基粒或发育不良,但类囊体膜上仍含有光合色素叶绿素等,所以鞘细胞显现绿色.至于有了叶绿素,就能完成光反应,尚有异议.主要的推测理由是认为C4植物的基质片层可能不完全具备完成光反应的条件,如可能不具备所需要的各种酶,化学反应和典型的光反应可能不一样,ATP和NADPH不能顺利生成.而实际上根据教材光反应是在基粒类囊体上进行的,因此没有基粒就没有光反应.……

NH_4^+-N部分代替NO_3^--N对番茄生育中后期氮代谢相关酶活性的影响

采用砂培实验研究NH4+-N部分代替NO3--N对番茄的影响,结果表明:与全硝处理(100%NO3-)相比较,增铵处理(NH4+∶NO3-=25%∶75%)下番茄鲜果重显著提高;同时叶片内NO3--N含量随增铵而显著降低,叶片与果实内NH4+-N含量及果实的可溶性蛋白含量随增铵而升高;增铵条件抑制了叶片和果实的硝酸还原酶(NR)活性,提高了叶片和果实的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPcase)活性及叶片谷氨酰胺合成酶(GS)活性,但对果实的谷氨酰胺合成酶(GS)活性影响不大。上述结果表明,NH4+-N部分代替NO3--N可增加番茄产量,提高集约化基地的生产量。

异子蓬PEPC基因原核表达及其重组菌在非生物胁迫下的耐受力解析

该研究在Escherichia coli Transetta（DE3）中表达了C4盐生植物异子蓬的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEPC）,并进行了酶学特性及非生物胁迫响应分析,以期初步阐明PEPC基因在非生物胁迫下的生物学功能,为异子蓬PEPC的非生物胁迫的抗性生理研究提供参考依据。基于5′-RACE技术获得异子蓬PEPC全长基因（GenBank登录号为KP985714）,构建了E.coli Transetta：：pGEX-4T-1-PEPC重组菌株。通过分光光度法和酶联免疫吸附技术（ELISA）分别测定了PEPC重组蛋白的酶活和含量,并检测E.coli Transetta：：pGEX-4T-1-PEPC重组菌株在非生物胁迫下的耐受性。生物信息学分析发现,该PEPC基因的cDNA全长为2 901bp,编码966个氨基酸,与甜菜（Beta vulgaris）PEPC的氨基酸序列一致性达90%,具有PEPC的典型保守结构域（PEPcase）以及VlTAHPTQsiRR和VMIGYSDSgKDAG活性位点;PEPC蛋白属PEPC-1型的不含信号肽的非分泌型亲水蛋白。Western blot结果显示,融合GST的PEPC蛋白的分子量约130~140kD;在37℃用0.8 mmol/L IPTG诱导E.coli Transetta：：pGEX-4T-1-PEPC重组菌株显示出更高的PEPC酶活及含量,而且E.coli Transetta：：pGEX-4T-1-PEPC重组菌在200~800mmol/L NaCl、5%~20%聚乙二醇（PEG）6 000、25℃~52℃温度范围、50~400μmol/L甲基紫精和pH 3.0~11.0的非生物胁迫下生长均明显优于对照。研究表明,异子蓬PEPC基因的表达提高了E.coli耐受非生物胁迫的能力。

高粱C_4型pepc基因转入大豆可改善大豆光合特性

改善作物的光合性能能够有效突破作物的产量潜力,目前国内关于转高粱C4型pepc基因大豆的研究尚未见报道。本研究以东北地区主栽大豆品种‘黑农41’为材料,通过农杆菌介导法将高粱C4型全长pepc基因转入‘黑农41’,获得了转基因植株。通过对转基因植株T0代和T1代进行了分子生物学检测、农艺性状调查和生理指标检测,结果表明目的基因已整合到大豆基因组中,T0代和T1代植株的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均有不同程度的提高,而胞间CO2浓度降低,其中T0代和T1代植株的净光合速率分别比对照提高了37.4%和20.7%,在T1代净光合速率增幅最大的T1-3-3,单株产量增加也最多,说明pepc基因的导入改善了转基因植株的光合特性,进而使转基因大豆产量提高。本研究可为高光效转基因大豆新品种的选育提供重要素材。

外源海藻糖增强高表达转玉米C4型PEPC水稻耐旱性的机制

为揭示海藻糖(Tre)调控转玉米(Zea mays)C4型PEPC基因水稻(Oryza sativa)(PC)的耐旱性机制,以PC及其野生型Kitaake(WT)为材料,通过水培试验,研究了Tre和12%(m/v)聚乙二醇(PEG)单独或联合处理对水稻生理生化特性的影响。结果表明,Tre处理可促进PC和WT水稻幼苗生长,缓解干旱逆境导致的植株生长抑制,但对PC的效应更显著。与DS处理相比,Tre+DS联合处理可维持功能叶较高的相对含水量、光化学效率和抗氧化酶活性。在DS处理下,与WT相比,外施Tre可使PC的内源Tre和蔗糖含量显著增加,而葡萄糖含量显著降低,Tre代谢和SnRK1s相关基因表达量增加;施用Tre也显著促进了ABA合成、信号转导与干旱响应基因的表达,和维持较稳定的光合能力,从而使PC表现更强的耐旱性。

代谢工程大肠杆菌高效利用甘油合成丁二酸

为了构建高产丁二酸的重组大肠杆菌,以删除了乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶基因(ackA-pta)、乳酸脱氢酶基因(ldhA)和丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)的大肠杆菌CICIM B0013-025为出发菌株,将其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因的启动子替换为温度诱导的λ噬菌体启动子P_L-P_R,获得温度调控型的丁二酸合成菌株B0013-026。继而通过发酵条件优化,建立了两阶段发酵法:菌株的生长温度和诱导温度分别为37和42℃,以甘油为碳源并添加入5 g/L蛋白胨,发酵产酸阶段在微供氧(100 r/min)条件下进行。在5 L发酵罐中采用最优条件进行发酵,丁二酸的产量、生产强度和甘油转化率分别为62.5 g/L、1.04 g/(L·h)和64.2%,而且发酵液中仅有少量的α-酮戊二酸(3.0 g/L)和乙酸(1.8 g/L)等副产物积累,实现了以甘油为唯一碳源高效合成丁二酸,为其工业化生产提供了重要参考。

硅藻C4光合作用研究回顾与展望

硅藻(Bacillariophyta)是海洋浮游植物的主要类群之一,也是海洋生态系统中的主要初级生产者,在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。20世纪70年代以来,科学家们陆续发现了硅藻的某些种类中可能存在C4光合作用,但直至目前,人们对硅藻C4光合作用的认识还很有限。本文主要对硅藻C4光合作用发现的历程、二氧化碳浓缩机制及其与高等植物C4光合作用的比较进行论述,解析硅藻C4光合作用的机制。

生物素对2型糖尿病大鼠血糖的影响

目的探讨生物素对2型糖尿病大鼠血糖以及糖代谢关键限速酶葡萄糖激酶(GCK)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1(PCK1)基因表达的影响。方法 90只健康Wistar大鼠根据血糖随机分为5组(正常对照组,模型组,生物素低、中、高剂量组)。正常对照组给予普通维持饲料,蒸馏水灌胃;模型组给予高脂高糖饲料,蒸馏水灌胃;生物素各剂量组给予高脂高糖饲料同时分别给予生物素0.6、3.0和6.0 mg/kg BW灌胃。在高脂高糖饲料喂养2月后,应用小剂量链脲佐菌素腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型。于造模第10周进行OGTT实验后,处死大鼠。检测血糖、血清胰岛素、肝糖原、肌糖原等指标,用RT-PCR方法检测糖代谢关键限速酶GCK、PCK1基因的表达。结果与模型组相比,生物素各剂量组对空腹血糖、血清胰岛素没有影响,但生物素高剂量组血糖曲线下面积明显下降(P<0.05),餐后30 min血糖值也显著降低(P<0.05)。生物素中剂量组和高剂量组肌糖原含量明显下降(P<0.05)。生物素对糖代谢关键限速酶GCK、PCK1的表达有影响,分别出现了明显的基因表达上调和下调(P<0.05)。结论生物素可能通过影响糖代谢关键酶GCK和PCK1的活性,促进糖酵解和糖原合成而抑制糖异生,从而影响餐后血糖应答。