与鸭C4结合蛋白互作的鸭疫里默菌外膜蛋白的筛选及鉴定

旨在筛选并鉴定与鸭C4结合蛋白(C4b-binding protein,C4BP)互作的鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,R.anatipestifer)外膜蛋白。本研究将保存的R.anatipestifer复苏培养,提取外膜蛋白,以鸭C4BPα作为诱饵蛋白进行His pull-down及LC-MS/MS蛋白质谱鉴定,筛选与鸭C4BP可能发生互作的候选外膜蛋白;将各候选蛋白进行克隆、原核表达,免疫小鼠制备多克隆抗体,利用Far-western blot验证与鸭C4BP发生相互作用的R.anatipestifer外膜蛋白;针对候选蛋白及C4BPα各功能结构域进行克隆及原核表达,利用Far-western blot鉴定候选蛋白及与C4BP的相互作用位点;利用ELISA对补体因子C3b、C4b及C4BP在R.anatipestifer表面沉积情况进行测定,验证候选蛋白的功能。结果显示,经His pull-down及LC-MS/MS蛋白质谱分析,共筛选出3个与鸭C4BP发生相互作用的R.anatipestifer外膜蛋白,即ECE-1、SODs和Omp62;成功获得3个外膜蛋白多克隆抗体,ELISA检测3种多克隆抗体效价均超过1∶6400,Western blot检测3种多克隆抗体可以与重组蛋白发生特异性反应;Far-western blot结果显示,仅ECE-1能够与C4BP发生相互作用,并且只有ECE-1全长能与鸭C4BP相互作用,而鸭C4BP与ECE-1的相互作用区域位于C4BPα的SCR 2和SCR 3;当健康鸭血清稀释度为3.125%时,ECE-1抗体能够显著促进补体因子C3b、C4b在R.anatipestifer表面的沉积作用(P<0.05),当健康鸭血清稀释度为6.25%时,ECE-1抗体能够显著抑制C4BP在R.anatipestifer表面的沉积作用(P<0.05)。本研究成功筛选并鉴定出1个与C4BP互作的R.anatipestifer外膜蛋白ECE-1,为进一步阐明R.anatipestifer免疫逃逸机制奠定了基础。

抗人C4结合蛋白单克隆抗体的制备及某些方法的改进

用易于获得的C4BP/C4混合抗原免疫小鼠,EAC1q4C4BP血球间接血凝法作为筛选手段,获得了分泌抗C4BP抗体的杂交瘤细胞株。用单克隆抗体制成的亲和柱分离的C4BP,有C4BP的电泳特性和抑制EAC14与C2形成C3转化酶的活性。本文同时报告单克隆抗体制备方案的某些改进:1.小鼠免疫过程中用尾尖近似定量微量采血法对血中抗体水平定期监测,选择合适的小鼠供脾;2.用戊二醛固定的检测血球筛选杂交瘤,方法简便迅速,改变了杂交瘤筛选工作繁重的局面;3.用单细胞分离法达到单克隆化,缩短工作周期。

膀胱癌患者癌组织ABCC4、miR506-3-p表达水平及临床意义

目的检测膀胱癌患者ATP结合盒转运蛋白C4(ABCC4)和微小RNA-506-3p(miR-506-3p)的表达水平,并探讨其与患者预后的关系。方法选取2015年5月至2017年5月该院收治的78例膀胱癌患者作为研究对象,术中收集所有患者膀胱癌组织及癌旁组织(距离癌组织边缘≥3 cm)。采用免疫印迹法或实时荧光定量PCR技术检测各组织ABCC4蛋白、mRNA及miR-506-3p的表达水平,分析ABCC4蛋白和miR-506-3p表达的相关性、靶向调控关系,以及二者与膀胱癌患者临床病理特征、术后4年总生存率的关系;COX回归分析影响膀胱癌患者预后的危险因素。结果膀胱癌组织ABCC4蛋白和mRNA的表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05),而膀胱癌组织miR-506-3p的表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05)。膀胱癌组织中ABCC4蛋白与miR-506-3p表达呈负相关(P<0.05),且miR-506-3p可靶向调控ABCC4;膀胱癌组织ABCC4蛋白的表达水平与肿瘤分期、肿瘤最大径和是否发生淋巴结转移有关(P<0.05),miR-506-3p表达水平与肿瘤分期有关(P<0.05)。ABCC4蛋白高表达组患者总生存率明显低于低表达组(P<0.05),miR-506-5p高表达组总生存率明显高于低表达组(P<0.05);肿瘤分期及膀胱癌组织ABCC4蛋白、miR-506-3p表达是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。结论ABCC4在膀胱癌组织中表达上调,而miR-506-3p在膀胱癌组织中表达下调,且二者呈负相关。ABCC4、miR-506-3p均具有作为膀胱癌预后标志物和治疗靶点的潜力。

ATP结合转运蛋白C4与肿瘤及化疗药物的研究进展

ATP结合转运蛋白C4（ABCC4，MRP4）对于转运生理性、内源性或者外源性物质起重要作用。ABCC4基因在多种实体肿瘤和血液系统肿瘤中表达增高，并影响转移复发等过程。并且 ABCC4可降低多种化疗药物的细胞内浓度，下调细胞对化疗药物的敏感性，导致患者预后不良。

鸭C4BPα的克隆、表达及其与鸭疫里默氏菌的互作

为研究鸭C4结合蛋白(C4b-binding protein,C4BP)与鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)的相互作用,对鸭C4BPα进行克隆、原核表达,免疫小鼠制备多克隆抗体,并利用间接免疫荧光试验及斑点杂交试验验证C4BP与RA的相互作用。结果显示,鸭C4BPα核苷酸序列全长为1230bp,与鸡C4BPα的相似性最高(82.1%);系统进化树分析发现,鸭C4BPα与鸡C4BPα处于同一系统进化树分支上,两者遗传进化关系最近;C4BPα在大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)中能高效表达,重组蛋白以胞内可溶性形式存在;多克隆抗体效价超过1∶10000,并且可以与重组蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验和斑点杂交试验结果显示RA与鸭C4BP可以发生相互作用。研究结果为进一步揭示RA的致病机制奠定了基础。