基因芯片筛选LNCaP与C4-2细胞中P53信号通路相关差异表达基因

目的运用基因芯片筛选雄激素依赖性前列腺癌细胞系LNCaP与雄激素非依赖性前列腺癌细胞系C4-2中p53信号通路相关差异表达基因,寻找去势抵抗性前列腺癌的可能发生机制。方法体外培养前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2,TRIzol试剂提取两种细胞的总RNA并纯化,按Agilent芯片说明对总RNA进行杂交,所得荧光信号采用Aligent Scanner、Imagene和Genespring软件进行分析和显示。结果以LNCaP为对照,C4-2细胞中3组均表达差异的基因共417个,上调基因301个,下调基因116个。KEGG转录域覆盖率分析显示,差异表达基因中与p53信号通路相关的占9.3%;p53信号通路中表达差异的基因分别为ATR、p21、CDK4/6、Cyclin E、Gadd45、PIGs、CytC、IGFBP3、TSP1、p53R2、Sestrins和Cyclin G,其中p21、CDK4/6、Cyclin E的表达差异最显著。结论筛选出在LNCaP和C4-2细胞系p53信号通路中差异表达基因12个,其中p21、CDK4/6、Cyclin E可能参与了CRPC的发生发展,为进一步研究前列腺癌的进展机制奠定了基础。

王不留行作用于C4-2细胞株的基因靶点研究

目的 通过“健脾利湿化瘀方”单药王不留行作用于C4-2细胞株的基因靶点研究,揭示王不留行逆转人前列腺癌C4-2细胞的雄激素非依赖性生长的信号通路。方法 将不同浓度的王不留行作用生长状况良好、对数期的人前列腺癌C4-2细胞株,经过48 h后观察细胞状态,选取细胞存活率高的王不留行组,进行基因芯片检测。结果 王不留行作用于人前列腺癌C4-2细胞,实验组与对照组共有6 851个差异基因,上调基因3 921个,下调基因2 930个。王不留行主要发挥作用的核心信号通路可能是mTOR signaling pathway。王不留行对增殖、凋亡调节的靶基因主要可能为RPS6KA1、CDKN1B、MTOR。结论 王不留行对人前列腺癌C4-2细胞的增殖具有抑制作用,通过进一步研究发现,其主要的信号通路可能是mTOR signaling pathway,对细胞增殖、凋亡等生物学功能起调控作用。

敲低前列腺癌相关基因PC-1的表达抑制前列腺癌细胞C4-2雄激素非依赖性生长

目的:研究敲低癌基因D52家族成员PC-1的表达对前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长的影响。方法:利用RNA干扰技术构建PC-1稳定低表达的C4-2细胞株;利用四唑盐(MTT)比色实验检测敲低PC-1基因表达对C4-2细胞雄激素非依赖生长的影响。结果:敲低PC-1表达抑制前列腺癌C4-2细胞的生长,并降低了C4-2细胞雄激素非依赖性生长的能力。结论:PC-1基因参与了前列腺癌向雄激素非依赖阶段发展和维持的过程,为进一步研究PC-1在促进前列腺癌细胞发生发展过程中的作用奠定了基础。

王不留行环肽B逆转前列腺癌C4-2细胞激素非依赖性生长及作用机制

目的明确王不留行逆转人前列腺癌C4-2细胞激素非依赖性生长的单体成分,探究王不留行抑制去势抵抗性前列腺癌发生发展的作用机制。方法采用CCK-8法检测王不留行单体成分对C4-2细胞增殖的影响;采用CCK-8法联合Annexin V-APC法检测王不留行单体成分对C4-2细胞雄激素非依赖性生长的作用;采用Western blotting检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路和雄激素受体(androgen receptor,AR)蛋白表达;过表达AR后,采用荧光素酶报告基因检测AR的转录活性。结果王不留行环肽B对C4-2细胞增殖的抑制作用最为显著。在有雄激素的条件下,王不留行环肽B对C4-2细胞凋亡的诱导作用和对细胞增殖的抑制作用较弱;王不留行环肽B组p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平降低。过表达AR后,与对照组比较,双氢睾酮组AR蛋白表达水平和相对荧光素酶活力显著升高(P<0.05),王不留行环肽B组AR表达水平和相对荧光素酶活力显著降低(P<0.05);与双氢睾酮组比较,双氢睾酮+王不留行环肽B组AR蛋白表达水平和相对荧光素酶活力显著降低(P<0.05)。结论王不留行环肽B能明显抑制C4-2细胞增殖,具有逆转C4-2细胞激素非依赖性生长的作用,可以通过AR以及PI3K/Akt信号通路发挥抑制去势抵抗性前列腺癌发生发展的作用。

PC-1基因表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响

背景与目的:PC-1基因在雄激素非依赖和高转移能力的前列腺癌C4-2细胞中高表达,在雄激素依赖及不转移的前列腺癌LNCaP细胞中低表达。本实验旨在研究PC-1对前列腺癌细胞迁移能力的影响。方法:构建PC-1稳定高表达的LNCaP细胞株和反义核酸调低内源性PC-1表达的C4-2细胞株。利用体外迁移系统检测PC-1表达对LNCaP和C4-2细胞迁移运动能力的影响。结果:体外迁移实验表明稳定转染提高PC-1的表达水平并未使LNCaP迁移细胞数增多(P>0.05),而反义核酸降低PC-1表达则使C4-2迁移细胞数降低(P<0.05)。PC-1蛋白水平升高不能提高LNCaP细胞迁移能力,但降低内源性PC-1表达则使C4-2细胞迁移能力明显降低。结论:PC-1可能在前列腺癌细胞侵袭过程中起一定作用。

抑制细丝蛋白A促进前列腺癌C4⁃2细胞迁移

目的探讨细丝蛋白A(FLNA)对前列腺癌细胞迁移的影响。方法设计并构建靶向FLNA的shRNA敲低质粒pSIH⁃H1⁃shFLNA。包装慢病毒后感染前列腺癌C4⁃2细胞,获得敲低FLNA的稳定细胞系C4⁃2⁃shFLNA。Western印迹检测前列腺癌C4⁃2细胞中FLNA蛋白表达和PC⁃1蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)检测FLNA以及PC⁃1 mRNA表达水平;Western印迹检测敲低FLNA对磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响;划痕实验和Transwell实验检测C4⁃2细胞体外迁移能力。结果前列腺癌C4⁃2细胞敲低FLNA后FLNA mRNA和蛋白水平明显下调,PC⁃1 mRNA水平和蛋白水平表达增加,同时AKT磷酸化水平显著升高。划痕及Tran⁃swell实验证实在前列腺癌C4⁃2细胞中敲低FLNA后细胞迁移能力增强。结论前列腺癌细胞中敲低FLNA能够激活PI3K/AKT信号通路,促进前列腺癌细胞迁移。

健脾利湿化瘀方对人前列腺癌C4-2细胞雄激素非依赖性生长的影响

目的探究健脾利湿化瘀方治疗去势抵抗性前列腺癌的可能作用机制。方法将健脾利湿化瘀方根据药物功效拆分为扶正药、解毒药、化瘀药。实验分为全方组、扶正组、解毒组、化瘀组,每组设4个药物浓度,分别为10、20、100、1000 mg/ml,另设对照组(含培养液和细胞)。在96孔板加入人前列腺癌C4-2细胞悬液100μl (细胞数约1. 5×10^4个),培养24 h后根据实验分组加入不同浓度药物继续培养48 h。采用MTT实验计算各组细胞抑制率。根据结果再将全方和细胞抑制率最高的拆方组中单味药物作用于C4-2细胞,筛选细胞抑制率最高的单味药物。观察健脾利湿化瘀方全方和最佳单味药物分别对C4-2细胞在含与不含雄激素的培养基的细胞增殖情况,计算细胞抑制率。结果各组药物对人前列腺癌C4-2细胞的抑制率呈浓度依赖关系(P <0. 05),药物浓度越高,抑制率越高,在不同浓度药物干预下组间比较,抑制率由高到低分别为全方组>化瘀组>解毒组>扶正组,组间两两比较差异有统计学意义(P <0. 05),拆方中化瘀组是最佳药物组。在最佳单味药物细胞抑制率筛选中,细胞抑制率由高到低依次为王不留行组>全方组>大黄组>姜黄组(P <0. 05),提示王不留行是抑制人前列腺癌C4-2细胞增殖作用最佳的中药单药。全方组不含雄激素细胞抑制率与含雄激素差异无统计学意义(P> 0. 05),而王不留行组含雄激素细胞抑制率低于不含雄激素(P <0. 05),并且王不留行组含和不含雄激素细胞抑制率均高于相应的全方组(P <0. 05)。结论健脾利湿化瘀方对人前列腺癌C4-2细胞具有很好的抑制作用,且呈剂量依赖性。其中王不留行是最佳的单味中药,王不留行增加了人前列腺癌C4-2细胞对雄激素的敏感性,可能对人前列腺癌C4-2细胞的雄激素非依赖性生长具有逆转作用。

抑制miR-218的表达对人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响及其机制

目的探讨抑制miR-218的表达对人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞增殖、侵袭及迁移的影响及其机制.方法培养人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞,分为空白组、阴性对照组(NC组)、miR-218组;空白组未予以任何处理,NC组转染阴性对照序列,miR-218组转染miR-218抑制剂.各组细胞处理后继续培养5 d,然后收集细胞,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测转染后各组细胞miR-218的表达情况,采用WST-1细胞增殖实验和细胞平板克隆形成实验检测转染后各组C4-2细胞增殖、活性情况,采用划痕实验检测各组C4-2细胞迁移距离,采用Transwell小室检测细胞侵袭数量和迁移数量,采用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测TOB1基因mRNA表达情况,采用Western blot检测TOB1基因蛋白表达情况.结果qPCR结果显示:转染后NC组、miR-218组人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞miR-218的相对表达量分别为1.02±0.06、0.38±0.04,miR-218组中miR-218的表达明显低于NC组,差异有统计学意义(t=15.372,P<0.05).WST-1细胞增殖实验结果显示:(1)转染后空白组、NC组随着时间的延长,光密度(OD)值呈上升趋势,而miR-218组OD值在24、48 h时呈上升趋势,72 h时OD值开始明显下降;(2)空白组、NC组、miR-218组组间比较,OD值在0、24 h时3组间差异均无统计学意义(P值均>0.05),48、72 h时miR-218组OD值均小于空白组、NC组,差异均有统计学意义(F=12.615、24.523,P值均<0.05).细胞平板克隆形成实验结果显示:转染后空白组、NC组和miR-218组克隆形成数分别为(42.2±1.2)个、(41.3±2.4)个、(20.6±1.2)个,miR-218组明显少于空白组、NC组,差异均有统计学意义(F=155.530,P<0.05).划痕实验和Transwell小室细胞侵袭、迁移实验结果显示:转染后,miR-218组细胞迁移距离、侵袭细胞数和迁移细胞数均低于空白组和NC组,差异均有统计学意义(F=17.625、48.625、38.352,P值均<0.05);而空白组和NC组间细胞迁移距离、侵袭细胞数和迁移细胞数比较,差异均无明显统计学意义(P值均>0.05).RT-PCR和Western blot检测结果显示:转染后空白组、NC组、miR-218组TOB1基因mRNA的相对表达量分别为0.20±0.02、0.19±0.03、0.35±0.02,TOB1基因蛋白的相对表达量分别为0.22±0.01、0.23±0.02、0.68±0.02,miR-218组细胞中TOB1 mRNA和蛋白水平均明显高于空白组和NC组,差异均有统计学意义(F=18.615、22.523,P值<0.05);而空白组细胞中TOB1 mRNA和蛋白水平与NC组比较,差异均无统计学意义(P值>0.05).结论抑制人去势抵抗型前列腺癌C4-2细胞miR-218的表达,可抑制该细胞的增殖和活性,并抑制其侵袭和迁移能力,其机制可能与上调TOB1基因mRNA和蛋白表达有关.

基因芯片技术筛选前列腺癌雄激素去势抵抗相关基因

目的利用基因芯片技术高通量筛选前列腺癌雄激素去势抵抗相关基因，为研究雄激素去势抵抗进展前列腺癌的分子机制奠定基础。方法提取并纯化LNCaP及C4～2细胞的总mRNA，反转录合成荧光分子标记的cDNA，与基因芯片杂交；采用Genepix Pr06．0图像分析软件分析，筛选表达差异的基因；KEGG富集分析每个pathway中差异基因富集的显著性。结果在表达谱芯片中筛选出417个差异表达基因，包括301个C4～2细胞中表达上调基因，116个表达下调基因；KEGG富集分析显示，与前列腺癌相关的表达差异的基因有GF、EGFR、HSP、BAD、P21、E2F、Raf、CyclinE、PSA和Pj3K等，其中EGFR、Raf表达差异最明显。结论EGFR、Raf基因表达异常可能在雄激素去势抵抗型前列腺癌的形成过程中发挥着重要作用，本研究为前列腺癌去势抵抗进展分子机制的探索提供了理论依据。

应用基因芯片技术筛选前列腺癌雄激素去势抵抗相关的基因

目的利用基因芯片技术高通量筛选前列腺癌雄激素去势抵抗相关的基因,为研究雄激素去势抵抗进展及前列腺癌的分子机制奠定基础。方法提取并纯化LNCaP及C4-2细胞的总mRNA,反转录合成荧光分子标记的cDNA,与基因芯片杂交;采用Genepix Pro6.0图像分析软件分析,筛选表达差异的基因;KEGG富集分析每个pathway中差异基因富集的显著性。结果在表达谱芯片中筛选出417个差异表达的基因,包括301个C4-2细胞中表达上调的基因,116个表达下调的基因;KEGG富集分析显示与前列腺癌相关表达差异的基因有GF、EGFR、HSP、BAD、P21、E2F、Raf、CyclinE、PSA、PI3K等,其中EGFR、Raf、PSA表达差异最明显。结论 EGFR、Raf、PSA基因的表达异常可能在雄激素去势抵抗型前列腺癌的形成过程中发挥着重要的作用,本研究为前列腺癌去势抵抗进展的分子机制的探索提供了理论依据。

敲低B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因对子宫颈癌细胞顺铂敏感性的研究

目的探讨子宫颈癌C4-1细胞敲低B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2)的表达,提高人子宫颈癌C4-1细胞对顺铂(DDP)化疗敏感性的作用与机制。方法应用敲低Bcl-2慢病毒转染子宫颈癌C4-1细胞,将其分为对照组、空载组及敲低组,上述分组通过DDP处理后分别作为对照+DDP组、空载+DDP组和敲低+DDP组。采用RT-PCR法检测C4-1细胞Bcl-2 mRNA表达水平,采用流式细胞仪检测C4-1细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测C4-1细胞对DDP的敏感性。结果敲低组与空载组及正常对照组比较,C4-1细胞的凋亡率明显增加(P<0.05),C4-1细胞Bcl-2 mRNA表达量降低;敲低组+DDP组与空载+DDP组和对照+DDP组比较IC50值降低,上述差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒转染子宫颈癌C4-1细胞敲低Bcl-2表达可增加凋亡率,提高子宫颈癌C4-1细胞对顺铂的敏感性。

基因芯片分析前列腺癌细胞系中转移相关基因

目的:通过基因芯片技术检测具有不同转移潜能的前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2中表达差异的基因,寻找前列腺癌转移相关基因。方法:采用TRIzol一步法提取LNCaP和C4-2细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子标记的c DNA探针,与基因芯片杂交。采用Genepix Pro 6.0图像分析软件进行芯片图像分析,把图像信号转化为数字信号,然后以差异大于等于2倍的标准来确定差异表达基因。结果:在LNCaP与C4-2细胞中,表达差异的基因共有417个,上调基因301个,下调基因116个。分析显示差异表达基因分别与细胞增殖、代谢、细胞因子、细胞转移等相关,其中发现7个基因与肿瘤细胞的转移相关,分别为EGFR、EGF、PIK3R1、Cyclin E、HYAL1、GNAI1、AZGP1。结论:筛选出LNCaP与C4-2细胞系中7个转移相关基因,为进一步研究前列腺癌转移机制奠定了基础。

人前列腺癌cDNA文库的构建和筛选

目的:PC1基因是与前列腺癌相关的新基因,在雄激素非依赖和转移的前列腺癌晚期细胞系C42中高表达。为了进一步研究PC1基因的功能及作用机制,构建C42细胞的cDNA文库,寻找与前列腺癌相关基因PC1相互作用的蛋白。方法:从前列腺癌细胞系C42中提取总RNA,进而分离poly(A)+RNA,用poly(A)+RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组。通过文库片段、线性化的pGADT7Rec和诱饵质粒pGBKT7PC1C共转化酵母AH109菌株,在文库构建的同时进行与PC1相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线性化的pGADT7Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选。最后用Far Western印迹方法进一步从体外论证了PC1蛋白可与自身相互作用形成二聚体。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人前列腺癌cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000bp。共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105。接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106。筛选到4个与PC1蛋白相互作用的阳性克隆。从体外证明了PC1蛋白可形成二聚体。结论:此文库的多样性和库容量均符合筛选需求。可用于前列腺癌相关基因?